1、前言

1.1適用范圍

本指南介紹百邁客動(dòng)物類組織&核酸樣品的送樣要求及制備方法。采集送樣前請(qǐng)?jiān)敿?xì)閱讀。信息單中樣本名稱、組織部位必須與實(shí)物相符，避免因信息單與實(shí)物不符導(dǎo)致反復(fù)核對(duì)，影響樣本質(zhì)量、錄入周期，導(dǎo)致提取核酸質(zhì)量不滿足建庫(kù)測(cè)序要求，實(shí)驗(yàn)周期過(guò)長(zhǎng)等

1.2提取風(fēng)險(xiǎn)提示

核酸提取質(zhì)量與物種及組織部位、樣本制備、樣本交接、提取方法與操作、以及環(huán)境等因素息息相關(guān)，尤其是三代超長(zhǎng)提取對(duì)樣的要求更高。組織提取時(shí)可能受到上下游處理操作的影響，因此較難保證單次提取滿足質(zhì)量要求，望老師知悉理解，并做好組織備份。為保障獲得相對(duì)較高質(zhì)量的核酸，請(qǐng)老師務(wù)必按照以下指導(dǎo)原則準(zhǔn)備樣本。對(duì)于珍貴樣本或微量樣本，建議自行提取

2、組織送樣量要求

注1：未在表格出現(xiàn)的物種，請(qǐng)單獨(dú)溝通。送樣量結(jié)果展示為滿足提取一次的量，如樣品經(jīng)過(guò)特殊處理或樣本狀態(tài)異常有幾率影響得率，為了保證您的實(shí)驗(yàn)可以順利進(jìn)行，請(qǐng)酌情增加送樣量

注2：由于骨骼含有大量鈣鹽和礦物質(zhì)，細(xì)胞密度低，核酸含量較少；毛發(fā)暴露在外界環(huán)境，容易受到紫外線、溫度變化、微生物影響，導(dǎo)致核酸降解，毛干核酸含量低，毛囊周圍細(xì)胞多難獲取，為了保證您實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行，這兩個(gè)部位不建議送組織樣，建議自行提取

3、核酸送樣要求

1)核酸送樣需要提供相關(guān)檢測(cè)結(jié)果，DNA類核酸可提供以下檢測(cè)手段中的一種或多種檢測(cè)結(jié)果： Qubit、 NanoDrop、 AGE，同時(shí)請(qǐng)采取適當(dāng)?shù)募兓椒?，以避免多糖、多酚、蛋白或者核酸酶?duì)DNA樣品的污染，并詳細(xì)注明溶解DNA所使用的溶解液類型

2)如果您開(kāi)展的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目為miRNA的相關(guān)實(shí)驗(yàn)，并且提供的是總RNA的樣本，請(qǐng)務(wù)必確認(rèn)您采用的總RNA的提取方法保留了小RNA （ 包括miRNA），提取試劑盒型號(hào)備注送樣信息單中

3.1二代DNA送樣量要求

3.2三代DNA送樣量要求

3.3RNA類送樣量要求

1)針對(duì)核酸有雜質(zhì)、污染、粘稠、顏色等情況，需要過(guò)柱純化后送樣或者酌情增加送樣量

2)核酸樣品建議使用1.5ml、2ml EP管裝載樣品，其他保存管容易破裂且不利于保存樣品和后續(xù)實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展

3)為了防止樣品污染和混淆，禁止使用96孔板和深孔板裝載樣品

4)用乙醇沉淀的樣品由于運(yùn)輸中會(huì)有少量乙醇揮發(fā)，建議將樣品管蓋用封口膜纏繞4-5圈

5)考慮到核酸可能存在含有雜質(zhì)、顏色等物質(zhì)導(dǎo)致會(huì)產(chǎn)生大量損失的風(fēng)險(xiǎn)，為保證樣本一次檢測(cè)合格并節(jié)約寶貴的重送樣時(shí)間，送樣建議量是高于公司判定標(biāo)準(zhǔn)的，請(qǐng)?jiān)诤怂崃孔銐虻那疤嵯卤M量按照送樣建議來(lái)送樣。

4、樣品制備保存指南

4.1常規(guī)動(dòng)物類樣本

送樣需要選擇新鮮采集的樣本，尤其是Ultra long ONT建庫(kù)，樣本的取材優(yōu)先選擇核酸含量相對(duì)較高的組織，樣本制備優(yōu)先級(jí)：血液>內(nèi)臟>肌肉。活體取下新鮮組織（肌肉、肝臟或其他組織，避免用易于寄生微生物的表皮和腸道、可能有變異細(xì)胞的病變組織），立即剔除結(jié)締組織和脂肪組織等非研究所需的組織類型。對(duì)腫瘤組織的取材，應(yīng)盡可能準(zhǔn)確地判定腫瘤和正常組織，腫瘤組織應(yīng)將周圍的正常組織切除干凈（正常組織也應(yīng)將周圍的腫瘤組織切除干凈），腸道組織一定要把內(nèi)容物清洗干凈

4.1.1液氮速凍組織操作流程（所有產(chǎn)品適用）

1)提前準(zhǔn)備好冷凍組織的足量液氮，預(yù)裝樣品的凍存管，并在做好標(biāo)記（盡量不使用漢字命名，命名字符控制在5個(gè)以內(nèi)）

2)活體取下新鮮的組織

3)迅速用預(yù)冷的PBS溶液（RNase free）或0.9%生理鹽水將組織表面的殘留血液沖洗干凈

4)如果組織體積較大，將組織切成長(zhǎng)寬高均≤0.5 mm 的小塊（即黃豆大?。?/p>

5)將凍處理好的組織樣本混合均勻后保存于2 mL 或更大體積的螺口凍存管（RNase free）中，標(biāo)注編號(hào)

6)立即（20s內(nèi)）置于液氮中冷凍 3~4 h，然后轉(zhuǎn)移至-80 °C長(zhǎng)期保存

7)干冰運(yùn)輸

4.1.2TRIzol保存樣品制備流程（僅RNA細(xì)胞和研磨后的組織適用）

1)如果使用 TRIzol裂解液保存送樣，請(qǐng)務(wù)必先進(jìn)行液氮研磨破碎，樣品量取參考標(biāo)準(zhǔn)送樣量的1/3，然后溶于 TRIzol 中，組織樣品切勿過(guò)量

2)震蕩混勻，常溫裂解 5 min 后，使用低溫離心機(jī)12000g離心10min，將上清液轉(zhuǎn)至新的2.0ml離心管中（拍質(zhì)控照片，方便核查），轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，運(yùn)輸時(shí)選擇干冰寄送

3)禁止使用trizol保存組織樣品送樣

4.1.3RNAlater? Tissue Collection保存樣品制備流程（僅RNA適用）

1)用RNAlater? Solution保存組織之前，需要將組織切割成長(zhǎng)寬高均≤ 0.5 mm的小塊

2)如果組織帶血液或其他體液，需要過(guò)夜后更換一次RNAlater? Solution；不要將剛浸入RNAlater Solution中的樣本立即冷凍，需將樣本置于4 °C 保存過(guò)夜（使Solution充分浸潤(rùn)組織樣本），然后轉(zhuǎn)移至-20 °C 或-80 °C 長(zhǎng)期保存

3)RNAlater? Solution 不會(huì)影響組織結(jié)構(gòu)，可以把已保存的組織從 RNAlater? Solution中取出，切下實(shí)驗(yàn)所需的用量，把剩余的組織再放入到原來(lái)的保存液中繼續(xù)保存

4)保存于RNAlater? Solution中樣本，-20 °C 存放時(shí)，樣本不會(huì)結(jié)凍，但可能會(huì)有晶體析出，這并不影響后續(xù)的 RNA 提取工作；-80 °C 存放時(shí)，樣本會(huì)結(jié)凍， 在進(jìn)行 RNA 提取前，需置于冰上融化再進(jìn)行后續(xù)操作，解凍后的樣本可再次放入-80 °C 保存

5)一般來(lái)講，生物樣本保存于RNAlater? Solution中，37 °C可存放1天，25 °C（室溫）可存放1周，4 °C 可存放1個(gè)月，-20 °C 或-80 °C 可長(zhǎng)期保存。但鑒于生物樣本的特殊性及實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性，建議所有保存于RNAlater? Solution中樣本，都要置于-20 °C 或-80 °C 長(zhǎng)期保存

注：如果組織較小，建議優(yōu)先選擇此方式送樣

4.2全血

DNA類產(chǎn)品推薦使用EDTA抗凝管采集后分裝，RNA類產(chǎn)品優(yōu)先推薦使用PAXgene血液RNA管采集。血樣建議為新鮮采集，不建議保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。血液相關(guān)產(chǎn)品僅接收全血或分離的細(xì)胞樣本，不接收血清、血漿。

4.2.1DNA常規(guī)產(chǎn)品制備操作流程

1)用醫(yī)用抗凝管或已裝有抗凝劑（選用檸檬酸鈉或 EDTA 抗凝劑，由于會(huì)影響實(shí)驗(yàn)所以不可用肝素）的旋蓋管收集全血樣本

2)上下輕輕顛倒混勻十次后，分裝到常規(guī)EP管中（體積不要超過(guò)EP管的一半），轉(zhuǎn)移至-20或-80 °C長(zhǎng)期保存（實(shí)際根據(jù)采血管的說(shuō)明要求操作）

3)干冰運(yùn)輸

注1：血液采集管請(qǐng)盡量不要用需專門對(duì)應(yīng)提取試劑盒的采血管，以防送樣后我們因無(wú)對(duì)應(yīng)試劑盒影響提取時(shí)間（盡量送樣前溝通）

注2：采集完血液之后需將血液轉(zhuǎn)移至EP管中，玻璃材質(zhì)采血管冷凍之后易碎

4.2.2Ultra Long ONT樣本制備流程

4.2.2.1新鮮血液

1)采集血液（ 5- 10mL），然后加入含 EDTA 抗凝管中（不可使用肝素 、檸檬酸鈉等抗凝管，建議使用 Cell-Free 采血管，做好標(biāo)記（樣本名稱，日期，體積）

2)輕輕顛倒混勻十次，室溫正立放置

3)冰袋（4 °C ）運(yùn)輸需避開(kāi)節(jié)假日（注意冰袋盡可能多放，樣本置于中間，保證箱體溫度維持在 4 °C）。從血液離體算起，運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)人員手中不可超過(guò) 3 天

4.2.2.2凍存血液

1)血液用抗凝管采集后輕輕顛倒混勻十次

2)哺乳動(dòng)物血液分裝到 2ml 離心管里，1ml/管（至少2管，若血量不足，可根據(jù)實(shí)際情況送樣）

3)魚(yú)類、禽類、兩棲類全血分裝到 1.5ml 離心管里， 100ul/管（至少5管,若血量不足，可根據(jù)實(shí)際情況送樣）

4)做好標(biāo)記（樣本名稱， 日期，體積），液氮速凍，干冰寄送

4.2.3RNA產(chǎn)品制備操作流程

4.2.3.1PAXgene血液RNA管制備流程（人和靈長(zhǎng)類動(dòng)物優(yōu)先選擇該方式送樣）

1)PAXgene管的介紹

在研究細(xì)胞內(nèi) RNA 使用的許多分子測(cè)試中，采集全血是第一步。 這類測(cè)試中的最大挑戰(zhàn)是細(xì)胞內(nèi) RNA不穩(wěn)定，在采血后幾小時(shí)內(nèi)迅速降解。 此外，通過(guò)基因誘導(dǎo)過(guò)程，某些種類的 RNA 采血后在體外增加。 體外 RNA 降解和基因誘導(dǎo)均會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄物相對(duì)數(shù)量估計(jì)過(guò)低或過(guò)高。 PAXgene 血液RNA 管含有一種附加劑，通過(guò)減少體外 RNA 降解和盡量減少基因誘導(dǎo)，可穩(wěn)定體內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄譜。 與PAXgene 血液 RNA 套件配套使用時(shí)，PAXgene 血液 RNA 管可以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的基因轉(zhuǎn)錄物檢測(cè)和定量

2)采集前準(zhǔn)備

A.PAXgene Blood RNA Tube（2.5mL采血管，含專用RNA穩(wěn)定劑）

B.符合標(biāo)準(zhǔn)的靜脈采血裝置（無(wú)菌針頭、持針器、止血帶等）

C.毒用品（酒精棉片、碘伏等）

D.生物安全防護(hù)裝備（手套、護(hù)目鏡等）

3)采集流程

A.確保 PAXgene 血液 RNA 管使用前在 18-25?C 溫度下，且正確貼有標(biāo)本識(shí)別標(biāo)簽

B.如果 PAXgene 血液 RNA 管是待抽吸的唯一試管，應(yīng)當(dāng)先抽血至“丟棄管”，再抽血至 PAXgene 血液 RNA 管，這樣便可以灌注放血過(guò)程中使用的采血裝置的內(nèi)部空間。 否則，PAXgene 血液 RNA 管應(yīng)是放血程序中最后抽吸的試管

C.采用您所在機(jī)構(gòu)推薦的標(biāo)準(zhǔn)靜脈穿刺技術(shù)程序，使用采血裝置和試管固定器，采血2.5ml至 PAXgene 血液RNA 管

D.采血后立即輕輕地將PAXgene 血液 RNA 管倒置 8–10 次

E.在室溫下 (18–25?C) 直立存儲(chǔ) PAXgene 血液 RNA 管至少 2 小時(shí)，最多 72 小時(shí)，然后再處理或轉(zhuǎn)移至冷藏室 (2–8?C) 或冷凍室 (-20?C)。 若需要 -70?C / -80?C 的存儲(chǔ)溫度，請(qǐng)參見(jiàn)“PAXgene 血液RNA 管內(nèi)所采集標(biāo)本的冷凍和解凍程序” 以獲取詳細(xì)信息

4)注意事項(xiàng)

A.確保采血管在有效期內(nèi)，無(wú)漏液或變色（正常試劑為淡黃色）

B.不可預(yù)先打開(kāi)管蓋，避免穩(wěn)定劑失效

C.一旦受到碰撞，冷凍的 PAXgene 血液 RNA 管就容易破裂。為降低在運(yùn)輸期間破裂的風(fēng)險(xiǎn)，請(qǐng)按照處理玻璃管的方式來(lái)處理冷凍的試管。使用者必須確認(rèn)自己的 PAXgene 血液 RNA 管冷凍和運(yùn)輸協(xié)議

D.PAXgene 血液 RNA 管填充不足會(huì)導(dǎo)致血液與附加劑的比率錯(cuò)誤，且可能導(dǎo)致分析結(jié)果錯(cuò)誤或產(chǎn)品性能欠佳

E.PAXgene血液 RNA 系統(tǒng)不適用于采集和純化病毒 RNA

4.2.3.2EDTA抗凝管送樣制備流程

1)用醫(yī)用抗凝管或已裝有抗凝劑（選用檸檬酸鈉或 EDTA 抗凝劑，由于會(huì)影響實(shí)驗(yàn)所以不可用肝素）的旋蓋管收集全血樣本

2)上下輕輕顛倒混勻十次后，分裝到常規(guī)EP管中（體積不要超過(guò)EP管的一半），轉(zhuǎn)移至-20或-80 °C長(zhǎng)期保存（實(shí)際根據(jù)采血管的說(shuō)明要求操作）

3)干冰運(yùn)輸

4.3細(xì)胞

4.3.1貼壁細(xì)胞

4.3.1.1液氮速凍法

1)確定細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好；離心得到細(xì)胞沉淀（依據(jù)客戶實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞離心步驟，注意細(xì)胞離心要適度，不要使細(xì)胞離心過(guò)實(shí)而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機(jī)，轉(zhuǎn)速800g為宜）

2)棄去培養(yǎng)基，加入 1 mlLPBS（RNase free，室溫），輕輕將細(xì)胞沉淀懸起， 轉(zhuǎn)移至 2 mL 旋蓋尖底離心管（RNase free）中

3)離心（依據(jù)客戶實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞離心步驟，注意細(xì)胞離心要適度，不要使細(xì)胞離心過(guò)實(shí)而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機(jī)，轉(zhuǎn)速800g為宜）得到細(xì)胞沉淀，棄去PBS，液氮速凍2h之后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時(shí)選擇干冰運(yùn)輸寄送

4.3.1.2TRIzol裂解法

1)離心收集的細(xì)胞迅速溶于 TRIzol 裂解，每 5 X 10^6個(gè)細(xì)胞加 1 mL TRIzol

2)細(xì)胞溶于 TRIzol 后，如出現(xiàn)成團(tuán)，需用吸頭將細(xì)胞團(tuán)吹打散，或者激烈震蕩混勻，使細(xì)胞完全溶于 TRIzol 中充分裂解

3)室溫靜置5min，之后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時(shí)選擇干冰運(yùn)輸寄送

注：判斷裂解液加入量是否合適的標(biāo)準(zhǔn)可以根據(jù)細(xì)胞溶解物的黏度來(lái)判斷。在細(xì)胞剛?cè)芙鈺r(shí)，可以發(fā)現(xiàn)有絲狀物出現(xiàn)，若裂解液加入量合適，吹打幾次后，絲狀物會(huì)消失，液體黏稠性下降；若裂解液的量過(guò)少，絲狀物往往一直存在，液體黏稠性大，應(yīng)繼續(xù)補(bǔ)加裂解液。裂解液加入量過(guò)少，會(huì)導(dǎo)致抽提的 RNA 降解

4.3.2懸浮細(xì)胞

4.3.2.1液氮速凍法

1)確定細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好；離心得到細(xì)胞沉淀（依據(jù)客戶實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞離心步驟，注意細(xì)胞離心要適度，不要使細(xì)胞離心過(guò)實(shí)而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機(jī)，轉(zhuǎn)速800g為宜）

2)棄去培養(yǎng)基，加入 1 mlLPBS（RNase free，室溫），輕輕將細(xì)胞沉淀懸起， 轉(zhuǎn)移至 2 mL 旋蓋尖底離心管（RNase free）中

3)離心（依據(jù)客戶實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞離心步驟，注意細(xì)胞離心要適度，不要使細(xì)胞離心過(guò)實(shí)而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機(jī)，轉(zhuǎn)速800g為宜）得到細(xì)胞沉淀，棄去PBS，液氮速凍2h之后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時(shí)選擇干冰運(yùn)輸寄送

4.3.2.2TRIzol裂解法

1)離心收集的細(xì)胞迅速溶于 TRIzol 裂解，每 5 X 10^6個(gè)細(xì)胞加 1 mL TRIzol

2)細(xì)胞溶于 TRIzol 后，如出現(xiàn)成團(tuán)，需用吸頭將細(xì)胞團(tuán)吹打散，或者激烈震蕩混勻，使細(xì)胞完全溶于 TRIzol 中充分裂解

3)室溫靜置5min，之后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時(shí)選擇干冰運(yùn)輸寄送

5、注意事項(xiàng)

核酸提取質(zhì)量與物種及組織部位、采集方法及保存狀態(tài)、提取方法及操作、實(shí)驗(yàn)器材及環(huán)境等因素均有密不可分的聯(lián)系，尤其是三代超長(zhǎng)提取對(duì)樣本的質(zhì)量、總量要求更高，望知悉及理解，并做好樣本備份。為了保障獲得高質(zhì)量的核酸，請(qǐng)務(wù)必按照送樣手冊(cè)所規(guī)定的準(zhǔn)備樣本。對(duì)珍貴樣本或者微量樣本，建議自行提取

1)組織速凍時(shí)間：組織離體后，胞內(nèi)核酸便開(kāi)始降解，尤其是 RNA，故采集時(shí)，目的組織離體后，需立即速凍，建議 3min 內(nèi)完成，越快越好。速凍時(shí)間過(guò)短會(huì)導(dǎo)致速凍不徹底，核酸有降解風(fēng)險(xiǎn)

2)組織送樣量：建議送樣量適用于 95%的物種組織，少部分組織因胞內(nèi)核酸量較低，需適當(dāng)增加送樣量，比如動(dòng)物皮膚、毛發(fā)等。請(qǐng)嚴(yán)格按照上方組織送樣量要求送樣，送樣量過(guò)少或過(guò)多均不利于提取實(shí)驗(yàn)。采樣量較少會(huì)導(dǎo)致提取的核酸總量、濃度不合格，采樣量過(guò)多反而會(huì)造成速凍不徹底、提取取樣困難、凍融降解等危險(xiǎn)

3)組織狀態(tài)：不建議送組織狀態(tài)差或非生長(zhǎng)旺盛期樣品，核酸有一定幾率降解

4)組織保存管的選擇：所有組織樣品務(wù)必使用離心管或螺紋管保存，切勿直接裝入密封袋（低溫凍脆易破裂，導(dǎo)致樣品泄露，交叉污染）保存

5)組織樣品保存方法選擇：首選液氮速凍；沒(méi)有液氮條件的，可直接放入-80℃冰箱凍存。未使用液氮速凍或液氮速凍時(shí)間過(guò)短都有一定幾率導(dǎo)致核酸降解

6)組織送樣方式的選擇：干冰運(yùn)輸，且需要保證干冰的充足，冰袋和常溫送樣，有幾率導(dǎo)致核酸的降解。除RNA類樣品可使用RNAlater保存送樣，其余產(chǎn)品均建議送速凍組織，不建議使用保護(hù)液送樣，化開(kāi)離心會(huì)有幾率導(dǎo)致核酸降解；不建議酒精送樣，固定不徹底，有一定幾率殘留核酸酶，降解核酸

7)凍融組織： 組織凍存后，一旦凍融，核酸降解概率大于 80%，幾乎不可能提取成功，此類組織不建議送樣。請(qǐng)各位老師送樣前注意組織保存狀態(tài)， 確保組織未發(fā)生過(guò)凍融情況

8)帶血組織：由于血液沒(méi)有專業(yè)的保護(hù)劑，去除不凈一起速凍送樣會(huì)影響組織的完整性

9)長(zhǎng)年保存的組織：保存時(shí)間超過(guò)一年的組織不建議送樣

10)組織分離要求：正常組織樣本中不能含有病變組織，而病變組織樣本中也不可以?shī)A帶有正常組織，提取實(shí)驗(yàn)時(shí)無(wú)法精確取樣，無(wú)法稱重。組織量過(guò)多的不能全部取樣，只隨機(jī)選取適量組織提取

11)對(duì)于同一個(gè)組織樣品需要同時(shí)提取 DNA和 RNA 的，請(qǐng)務(wù)必分成兩管分批次送樣。樣本的特殊處理包括：鹽處理、溫度處理、藥物處理、病毒侵染、傷害處理、干旱處理等脅迫處理方式，不同程度的處理對(duì)樣本的核酸質(zhì)量會(huì)造成不同程度的影響，常見(jiàn)的會(huì)導(dǎo)致核酸 的降解或者得率降低。因此，經(jīng)過(guò)特殊處理的樣本，在送樣時(shí)，務(wù)必請(qǐng)?jiān)跇颖拘畔沃羞M(jìn)行詳細(xì)的備注，以便盡量提高提取的成功率和避免樣本的浪費(fèi)

6、不合格樣品存在風(fēng)險(xiǎn)

6.1樣本總量不足、濃度過(guò)低存在風(fēng)險(xiǎn)

1)文庫(kù)構(gòu)建失敗

2)文庫(kù)產(chǎn)量低不能上機(jī)測(cè)序或測(cè)序數(shù)據(jù)量不足

3)導(dǎo)致數(shù)據(jù)隨機(jī)性異常

4)數(shù)據(jù)質(zhì)量差

6.2降解樣本風(fēng)險(xiǎn)

1)文庫(kù)構(gòu)建失敗

2)文庫(kù)產(chǎn)量低不能上機(jī)測(cè)序或測(cè)序數(shù)據(jù)量不足

3)導(dǎo)致數(shù)據(jù)隨機(jī)性異常

4)數(shù)據(jù)質(zhì)量差

5)導(dǎo)致數(shù)據(jù)duplication比例高、隨機(jī)性差

6)導(dǎo)致Small RNA rRNA比例高，影響有效數(shù)據(jù)，文庫(kù)片段異常

6.3蛋白或其他雜質(zhì)污染

1)可能影響Small RNA電泳分離，造成切膠不準(zhǔn)，影響問(wèn)題質(zhì)量

2)可能影響RNA-seq磁珠分離導(dǎo)致建庫(kù)失敗，或即使達(dá)到上機(jī)要求也可能導(dǎo)致文庫(kù)隨機(jī)性差等問(wèn)題

3)文庫(kù)構(gòu)建失敗

4)文庫(kù)產(chǎn)量低不能上機(jī)測(cè)序或測(cè)序數(shù)據(jù)量不足

6.4目標(biāo)RNA含量低

1)總RNA達(dá)到要求，但由于樣本特異性，small RNA含量低于正常樣本，導(dǎo)致建庫(kù)失敗

2)總RNA達(dá)到要求，但由于處理或組織部位的特異性，mRNA降解或含量低，導(dǎo)致建庫(kù)失敗或者測(cè)序數(shù)據(jù)中rRNA 數(shù)據(jù)比例高

文章標(biāo)題：Spatial and single-cell transcriptomics reveal cellular heterogeneity and a novel cancer-promoting Treg cell subset in human clear-cell renal cell carcinoma

期刊名稱：Journal for ImmunoTherapy of Cancer

影響因子：10.3

合作單位：空軍軍醫(yī)大學(xué)（第四軍醫(yī)大學(xué)）

研究方法：單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，流式分選，RT-qPCR，Western blot，免疫組化，多重免疫組化，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

百邁客生物為該研究提供了百創(chuàng)DG1000單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序服務(wù)以及百創(chuàng)S1000空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)服務(wù)，文中百創(chuàng)S1000空間數(shù)據(jù)分析得到的細(xì)胞空間分布圖由百創(chuàng)開(kāi)發(fā)軟件BSTCellViewer展示。

研究背景

透明腎細(xì)胞癌ccRCC是腎細(xì)胞癌RCC的常見(jiàn)亞型，是腎癌相關(guān)死亡的主要原因，治療手段包括腎切除手術(shù)、靶向治療和免疫治療，但多數(shù)患者不能從免疫治療獲益，這與腫瘤微環(huán)境異質(zhì)性有關(guān)，因此有必要深入理解ccRCC的腫瘤微環(huán)境，助力開(kāi)發(fā)新型個(gè)性化診療方案。

材料及方法

研究材料：15名腎切除術(shù)的ccRCC患者組織樣本及其血液PBMC。對(duì)組織樣本區(qū)域進(jìn)行定義，分為腫瘤核心（TC），腫瘤-健康交界（IF，包括腫瘤邊緣TR和臨近健康腎組織AN），遠(yuǎn)端健康腎組織DN。

組別設(shè)計(jì)：實(shí)驗(yàn)組4名ccRCC患者樣本進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序&空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，驗(yàn)證組15名ccRCC患者樣本進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)&多重免疫熒光染色，151名ccRCC患者組織樣本&40名其他腎癌亞型患者組織樣本&6名捐獻(xiàn)者健康腎組織進(jìn)行多重?zé)晒饷庖呓M化染色。

研究方法：單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（4名患者不同區(qū)域腫瘤組織，按照CD45+細(xì)胞:CD45-細(xì)胞=9:1增加免疫細(xì)胞數(shù)據(jù)占比，n=12），空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（n=4）；流式分選，RT-qPCR，Western blot，免疫組化，多重免疫組化，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

研究結(jié)果

1.ccRCC組織細(xì)胞類型全面分析

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（scRNA-seq）數(shù)據(jù)顯示不同患者腫瘤組織的免疫微環(huán)境細(xì)胞組成相似，T細(xì)胞占比最高，特別是CD4+ T細(xì)胞。腫瘤區(qū)域（TC/TR）富集CD3+細(xì)胞以及CD8+ T細(xì)胞，而CD4+ T細(xì)胞基本分布在所有區(qū)域。此外，基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞豐度和分布存在差異，TR區(qū)域成纖維細(xì)胞比例顯著低于TC區(qū)域和AN區(qū)域，這一發(fā)現(xiàn)也在空間轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)中得到印證。

圖1-ccRCC組織中細(xì)胞群的全面分析

2.ccRCC細(xì)胞元程序的豐度以及異質(zhì)性

通過(guò)非負(fù)矩陣因子分解分析每個(gè)樣本scRNA-seq數(shù)據(jù)，得到可以代表ccRCC腫瘤細(xì)胞簇元程序的6個(gè)基因集，不同基因集代表著不同的程序，如基因集1代表著EMT（上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變）相關(guān)基因表達(dá)譜，基因集5也與EMT相關(guān)但與基因集1不同的是其包含VEGFA等。

進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)ccRCC亞群0~4簇與不同基因集表達(dá)譜匹配，5和6簇不與任何基因集匹配但具有細(xì)胞周期和應(yīng)激響應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)。RCC0簇和RCC2簇代表EMThigh腫瘤細(xì)胞并在IF區(qū)域富集，RCC1簇代表PT（近曲小管）細(xì)胞，擬時(shí)序分析結(jié)果顯示存在RCC0—>RCC2分化關(guān)系，但RCC2幾乎只在P2患者樣本中發(fā)現(xiàn)，表明RCC2可能與個(gè)別患者特征相關(guān)。RCC1、RCC3和RCC4細(xì)胞主要在組織而不是腫瘤區(qū)域富集，RCC4主要分布在AN和DN區(qū)域，RCC4在AN區(qū)域分布數(shù)量高于DN區(qū)域。RCC4高表達(dá)細(xì)胞因子受體基因，表明TME中分泌的促腫瘤細(xì)胞因子可能傾向于作用到RCC4，增加其轉(zhuǎn)變成癌細(xì)胞的概率，加速腫瘤逃逸，促進(jìn)腫瘤惡性化，與以往瘤旁附近不是完全的健康組織認(rèn)識(shí)相符合。

圖2-透明細(xì)胞RCC細(xì)胞元程序的豐度及異質(zhì)性

3.ccRCC基質(zhì)細(xì)胞的區(qū)域化特征和異質(zhì)性

scRNA-seq與空間數(shù)據(jù)均顯示，ccRCC存在8種激活的成纖維細(xì)胞簇，腫瘤區(qū)域成纖維細(xì)胞數(shù)量高于健康組織，其中CD24+IL32+成纖維細(xì)胞顯著富集在腫瘤區(qū)域，PTGDS+成纖維細(xì)胞幾乎全分布在AN，高表達(dá)ECM（胞外基質(zhì)）形成和EMT的成纖維細(xì)胞簇在IF較為富集，IL1R1+?CAF（腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞）表現(xiàn)出腫瘤促進(jìn)表型；7種EC（內(nèi)皮細(xì)胞）簇中4種（0,2,3和6）主要富集在腫瘤組織，3種（1,4和5）在健康組織富集，膠原蛋白EC（0簇）豐度最高，具有促腫瘤特征?？傊?，不同的ECM蛋白質(zhì)產(chǎn)生基質(zhì)細(xì)胞傾向于富集在IF并共定位，可能行駛多種功能，包括細(xì)胞-細(xì)胞交互和胞外組分重構(gòu)。

圖3-透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌中基質(zhì)細(xì)胞的區(qū)域特征和異質(zhì)性

4.ccRCC中MRC1+FOLR2+?TAM傾向于表現(xiàn)出更強(qiáng)的促癌表型

scRNA-seq數(shù)據(jù)與空間數(shù)據(jù)均顯示，4種TAM簇具有不同分布趨勢(shì)，TAM1主要分布在TC區(qū)域；TAM2高表達(dá)FOLR2、MRC1和CD163，可能是M2樣巨噬細(xì)胞且具有增強(qiáng)的免疫抑制特征，TAM4是組織駐留巨噬細(xì)胞，兩者主要分布在TR區(qū)域；TAM3表達(dá)炎癥響應(yīng)相關(guān)基因，在TR和AN區(qū)域富集。RNA速率分析顯示存在TAM4—>TAM2—>TAM1和TAM4—>TAM3兩種軌跡，以及從IF區(qū)域遷移到TC區(qū)域的趨勢(shì)。進(jìn)一步的功能分析顯示，IF區(qū)域的TAM2可能通過(guò)促進(jìn)EMT，TC區(qū)域的TAM2可能通過(guò)促進(jìn)腫瘤血管生成，起到促癌效應(yīng)。總之，TAM2不同的腫瘤促進(jìn)效應(yīng)可能與免疫抑制TME有關(guān)。

圖4-透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌中MRC1+FOLR2+?TAM傾向于表現(xiàn)更強(qiáng)的促癌表型

5.單細(xì)胞分析揭示ccRCC中存在表達(dá)IL1B的Treg

進(jìn)一步分析CD4+ T細(xì)胞簇，發(fā)現(xiàn)存在CD4+ 初始T細(xì)胞、Treg和濾泡樣輔助T細(xì)胞，不同簇的特征基因和空間分布模式不同，IF區(qū)域富集CD4+ 初始T細(xì)胞和PDE3B+ CD4+ T細(xì)胞，腫瘤區(qū)域富集Treg。其中，TC/TR區(qū)域CTLA-4+?Treg的占比以及Treg的FoxP3蛋白表達(dá)水平高于AN/DN區(qū)域，而CTLA-4+FoxP3-?Treg在所有組織中的分布較為均勻，表明腫瘤區(qū)域Treg細(xì)胞具有更強(qiáng)的免疫抑制功能。

進(jìn)一步分析Treg細(xì)胞簇，發(fā)現(xiàn)存在6種亞型，其中終末效應(yīng)Treg細(xì)胞（5）主要分布在IF區(qū)域，F(xiàn)OXP3表達(dá)水平較低且ICOS表達(dá)水平降低，表明細(xì)胞可能處于不穩(wěn)定狀態(tài)。

此外，終末效應(yīng)Treg細(xì)胞表達(dá)炎癥性細(xì)胞因子如IL1B，IL18和IL7，驗(yàn)證隊(duì)列的多重免疫熒光染色結(jié)果顯示IL-1β+終末效應(yīng)Treg是對(duì)ccRCC特異性腫瘤微環(huán)境信號(hào)的特異性響應(yīng)。發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中存在表達(dá)炎癥性細(xì)胞因子IL1B的終末效應(yīng)Treg細(xì)胞。

圖5-單細(xì)胞分析揭示透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌存在表達(dá)IL1B的Treg細(xì)胞群

6.IL-18通過(guò)ERK/NF-κB通路促進(jìn)強(qiáng)免疫抑制功能的終末效應(yīng)Treg細(xì)胞產(chǎn)生

空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果顯示不同Treg細(xì)胞100μm范圍內(nèi)激活的CD4+/CD8+ T細(xì)胞數(shù)量較少，終末效應(yīng)Treg細(xì)胞100μm范圍內(nèi)CD4+/CD8+ T細(xì)胞數(shù)量更少，表明終末效應(yīng)Treg細(xì)胞周圍應(yīng)答Treg細(xì)胞（Tresp）增殖受到更強(qiáng)的抑制。細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明終末效應(yīng)Treg細(xì)胞具有強(qiáng)免疫抑制功能。RNA速率分析結(jié)果表明效應(yīng)終末Treg可能由初始Treg細(xì)胞分化而來(lái)，體外實(shí)驗(yàn)表明IL-18可刺激CD4+CD25+ Treg細(xì)胞上調(diào)IL-1β表達(dá)，表明終末效應(yīng)Treg細(xì)胞產(chǎn)生和作用可能與IL-18有關(guān)。ERK激活劑/NF-κB激活劑促進(jìn)IL-18+ Treg細(xì)胞的產(chǎn)生，IL-18處理后Treg細(xì)胞ERK/NF-κB磷酸化水平增加，ERK抑制劑可抑制Treg細(xì)胞表達(dá)NF-κB但NF-κB抑制劑無(wú)法抑制ERK表達(dá)，綜上，這些結(jié)果表明IL-18可能通過(guò)ERK/NF-κB通路介導(dǎo)終末效應(yīng)Treg細(xì)胞的產(chǎn)生。

圖6-IL-18通過(guò)ERK/NF-κB通路促進(jìn)具有強(qiáng)免疫抑制功能的終末效應(yīng)Treg細(xì)胞產(chǎn)生

7.通過(guò)與MRC1+FLOR2+?TAM互作，終末效應(yīng)Treg細(xì)胞與存活率降低、免疫逃逸增加及腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)

確定終末效應(yīng)Treg細(xì)胞標(biāo)志基因（FOXP3、IL1B和FCER1G），TGCA泛癌數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，終末效應(yīng)T細(xì)胞浸潤(rùn)高的隊(duì)列與更低的整體存活率相關(guān)。細(xì)胞通訊分析結(jié)果顯示，巨噬細(xì)胞與終末效應(yīng)Treg細(xì)胞有著最多的互作配體-受體對(duì)，許多是免疫抑制互作，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)支持終末效應(yīng)Treg細(xì)胞與TAM2簇之間存在相互作用；IL1R1+?CAF與終末效應(yīng)Treg細(xì)胞也存在潛在聯(lián)系。僅在TC區(qū)域（與TR區(qū)域相比）發(fā)現(xiàn)NAMPT-INSR和TGFB1-(TGFBR1+TGFBR2)配受體互作，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)終末效應(yīng)Treg細(xì)胞LRRC32（該基因編碼的GARP是TGF-β1成熟和激活所必須的）表達(dá)水平高于傳統(tǒng)Treg細(xì)胞。

此外，巨噬細(xì)胞特別是TAM2高表達(dá)IL18。這些結(jié)果可能表明ccRCC腫瘤微環(huán)境中，IF區(qū)域終末效應(yīng)Treg細(xì)胞與臨近TAM2互作，通過(guò)分泌的TGF-β1、M-CSF1以及IL-10，將IF駐留的TAM轉(zhuǎn)變成促癌表型，引起腫瘤細(xì)胞EMT；TAM2分泌的趨化因子誘導(dǎo)Treg細(xì)胞遷移到腫瘤區(qū)域并過(guò)表達(dá)IL-18，將Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)變成IL-1β+ 終末效應(yīng)T細(xì)胞，抑制T細(xì)胞免疫并促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。

總之，這些結(jié)果表明ccRCC的IF區(qū)域，終末效應(yīng)Treg細(xì)胞可能與其他促癌細(xì)胞互作，最終促進(jìn)腫瘤細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，支持了終末效應(yīng)Treg細(xì)胞具有免疫抑制和促癌作用的假設(shè)。

研究結(jié)果

該研究系統(tǒng)描述了ccRCC中不同類型細(xì)胞的基因表達(dá)譜和空間分布規(guī)律，發(fā)現(xiàn)一種具有癌癥促進(jìn)作用的新Treg細(xì)胞亞型，在腫瘤-健康組織交界區(qū)域與MRC1+FOLR2+?TAM互作，構(gòu)建免疫抑制TME，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化最終引起患者存活率降低。同時(shí)，這些發(fā)現(xiàn)也為開(kāi)發(fā)新的藥物和預(yù)后標(biāo)志物提供了靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

Song X, et al. Spatial and single-cell transcriptomics reveal cellular heterogeneity and a novel cancer-promoting Treg cell subset in human clear-cell renal cell carcinoma. J Immunother Cancer. 2025 13(1):e010183.

2025年3月，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院器官移植研究所蘭培祥教授、陳知水教授和肝臟外科程琪教授研究團(tuán)隊(duì)在Journal of Hepatology發(fā)表題為”Sour Neuronal Signalling Attenuates Macrophage Mediated Liver Injury”的研究論文。研究使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)等多種技術(shù)，深入闡述人鼠中減輕肝缺血再灌注損傷的腦-肝軸調(diào)控通路，發(fā)現(xiàn)酸味刺激竟然可以通過(guò)神經(jīng)信號(hào)緩解肝臟損傷！這一發(fā)現(xiàn)不僅為肝臟疾病的治療提供了新思路，還從現(xiàn)代科學(xué)的角度驗(yàn)證了中醫(yī)“酸入肝”的理論。

文章標(biāo)題：Sour Neuronal Signalling Attenuates Macrophage Mediated Liver Injury

期刊名稱：Journal of Hepatology

影響因子：26.7

合作單位：華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院

百邁客生物為該研究提供了10X單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)服務(wù)。

研究背景

在中醫(yī)理論中，酸味與肝臟有著密切的關(guān)系。中醫(yī)經(jīng)典《黃帝內(nèi)經(jīng)》中提到“酸入肝”，認(rèn)為酸味食物能夠滋養(yǎng)肝臟，調(diào)和氣血，促進(jìn)肝臟的生理功能。像檸檬、山楂、醋等酸味食物，常被用來(lái)調(diào)理肝氣郁結(jié)、疏肝解郁。這次的研究，不僅讓中醫(yī)的古老智慧得到了科學(xué)驗(yàn)證，還為酸味在肝臟疾病治療中的應(yīng)用提供了新的依據(jù)。

肝損傷是多種肝病常見(jiàn)的病理生理基礎(chǔ)，與炎癥有關(guān)。肝缺血再灌注損傷是一種局部無(wú)菌炎癥響應(yīng)，主要由先天免疫細(xì)胞驅(qū)動(dòng)，是肝切除術(shù)中早期器官功能障礙和衰竭的重要原因。傳統(tǒng)認(rèn)為肝缺血再灌注引起的炎癥是由肝和死亡細(xì)胞釋放的DAMP（損傷相關(guān)分子蛋白）被肝駐留庫(kù)普夫細(xì)胞、單核細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞等識(shí)別，釋放趨化因子和促炎癥因子，招募循環(huán)白細(xì)胞促使炎癥發(fā)生。此外，近年來(lái)，神經(jīng)免疫調(diào)控成為研究熱點(diǎn)，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)系統(tǒng)可以通過(guò)釋放神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)肽等分子來(lái)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。然而，如何通過(guò)神經(jīng)信號(hào)來(lái)治療肝臟炎癥，仍然是一個(gè)未解之謎。

材料及方法

研究方法：單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（n=3，肝及腹腔神經(jīng)節(jié)），組織學(xué)染色，熒光染色，病毒示蹤，免疫印記，免疫沉淀串聯(lián)質(zhì)譜，bulk RNA-seq，qRT-PCR，流式細(xì)胞術(shù)等。

研究材料：C57BL/6J小鼠缺血再灌注損傷模型，Fam19a2-/-Ccr2-/-小鼠，小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系HT122。

研究結(jié)果

1.酸刺激減輕肝缺血再灌注損傷

研究者首先構(gòu)建酸刺激下肝臟缺血再灌注損傷（IRI）小鼠模型，發(fā)現(xiàn)酸刺激可以減少肝組織損傷以及血清標(biāo)志物水平。但是，使用丁卡因局麻小鼠舌頭或者灌胃檸檬酸不能減少肝損傷和血清標(biāo)志物水平；NMDAR阻斷劑1（阻斷NMDAR介導(dǎo)的興奮性突觸傳遞）立體定位注射到腹后內(nèi)側(cè)核（VPN）后，酸刺激后IRI肝的血清標(biāo)志物水平和肝損傷程度無(wú)明顯變化，表明神經(jīng)系統(tǒng)在酸刺激減輕IRI過(guò)程中起重要作用。此外，小鼠VPN注射示蹤病毒的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，肝臟以及CG（腹腔神經(jīng)節(jié)）均檢測(cè)到熒光，行腹腔神經(jīng)節(jié)切除術(shù)能降低IRI肝的組織損傷和血清標(biāo)志物水平，表明酸刺激減輕肝損傷過(guò)程通過(guò)腦-CG-肝軸。

圖1-酸通過(guò)神經(jīng)減輕小鼠肝臟缺血再灌注損傷

圖2-腦和肝中分布的H129感染神經(jīng)

2.酸刺激通過(guò)減少TAFA2產(chǎn)生降低肝IRI

對(duì)肝IRI小鼠、酸刺激后肝IRI小鼠及sham（假手術(shù)）小鼠的肝臟和CG進(jìn)行單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，結(jié)果顯示IRI引起肝細(xì)胞和神經(jīng)元基因表達(dá)譜發(fā)生變化，IRI肝中免疫細(xì)胞數(shù)量增加，但酸刺激后IRI樣本中免疫細(xì)胞數(shù)量減少。神經(jīng)元較為特異性地表達(dá)TAFA2，IRI可引起肝神經(jīng)元TAFA2表達(dá)水平增加，但酸刺激使得TAFA2表達(dá)水平降到與sham對(duì)照組相近水平。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鉀離子可引起小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系HT22顯著高表達(dá)TAFA2，使用鉀離子通道抑制劑可減輕肝損傷，支持酸刺激通過(guò)神經(jīng)系統(tǒng)減輕肝損傷的假設(shè)。進(jìn)一步的，使用慢病毒敲低神經(jīng)元TAFA2表達(dá)水平或使用TAFA2敲基因鼠，發(fā)現(xiàn)IRI引起的肝組織損傷、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)以及血清標(biāo)志物水平降低，表明TAFA2在肝IRI中有著重要作用。

圖3-酸刺激減少小鼠IRI肝中神經(jīng)細(xì)胞Fam19a2表達(dá)水平

圖4-Fam19a2敲除或敲低，使得小鼠肝臟缺血再灌注損傷降低

?3.IRI肝中TAFA2與巨噬細(xì)胞相互作用

體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TAFA2不引起肝細(xì)胞凋亡；snRNA-seq數(shù)據(jù)顯示IRI肝中巨噬細(xì)胞比例增加且炎癥相關(guān)基因表達(dá)水平增加，但在酸刺激組中降低；流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TAFA2與巨噬細(xì)胞結(jié)合而不與T/B細(xì)胞結(jié)合，不論是否酸刺激T/B細(xì)胞比例無(wú)顯著變化，IRI肝中CD11b+F4/80low?巨噬細(xì)胞增加而酸刺激可降低該巨噬細(xì)胞數(shù)量；TAFA2敲除或敲低抑制IRI肝中巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)，這些結(jié)果表明TAFA2促進(jìn)巨噬細(xì)胞活化。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TAFA2可以激活BMDM（骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞），引起Il1α，Il1β，Il6和Tnfα的表達(dá)，這些結(jié)果表明TAFA2激活的巨噬細(xì)胞介導(dǎo)了肝IRI。

圖5-TAFA2使得IRI中巨噬細(xì)胞比例增加，刺激炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生

4.TAFA2通過(guò)CCR2與巨噬細(xì)胞互作

體外實(shí)驗(yàn)表明巨噬細(xì)胞上的CCR2是TAFA2受體，CCR2敲除小鼠IRI肝的組織損傷以及巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)降低，血清標(biāo)志物水平降低。TAFA2或CCL2刺激后BMDM的bulk RNA-seq數(shù)據(jù)表現(xiàn)出幾乎一致的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜，粘附、代謝、Ras信號(hào)通路相關(guān)差異基因表達(dá)上調(diào)，代謝和核糖體通路相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)，TAFA2誘導(dǎo)BMDM更高的表達(dá)Il1α，Il1β，Il6，Tnfα以及干擾素相關(guān)基因，促進(jìn)巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥響應(yīng)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明TAFA2促使巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥響應(yīng)主要依賴CCR2，但巨噬細(xì)胞上也可能存在其他的TAFA2受體。

圖6-TAFA2與巨噬細(xì)胞表面CCR2互作

5.酸刺激減輕人類肝切除術(shù)中肝IRI

為了確認(rèn)酸刺激在人類肝IRI中的作用，研究者進(jìn)行了開(kāi)放、隨機(jī)、空白對(duì)照臨床試驗(yàn)（ChiCTR2400088096），包含多種良性/惡性肝腫瘤、肝外傷、膿腫、囊腫和包蟲(chóng)病，由于手術(shù)期間門靜脈短暫阻斷以減少肝切除過(guò)程中出血，導(dǎo)致肝出現(xiàn)缺血再灌注損傷。干預(yù)組33名患者，術(shù)前24h開(kāi)始，每8h給與新鮮的25mM檸檬酸（持續(xù)5min），對(duì)照組33名患者不接受酸刺激，剔除6名術(shù)中肝缺血超過(guò)30min患者以及4名依從性差患者，肝切除術(shù)后第1/3/5天對(duì)患者肝功能進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果顯示酸刺激組血清ALT和AST水平顯著低于對(duì)照組，高ALT水平（>500 U/L）患者數(shù)量也顯著更低，這些結(jié)果表明酸刺激可減輕人類肝切除術(shù)引起的肝IRI。

圖7-酸刺激減輕人類肝切除術(shù)中肝IRI

研究總結(jié)

該研究首次揭示了腦-肝軸在肝臟IRI中的調(diào)控作用，闡明了酸味刺激通過(guò)神經(jīng)信號(hào)通路緩解肝臟損傷的機(jī)制。研究不僅為肝臟IRI的治療提供了新的思路，還為神經(jīng)免疫調(diào)控在其他器官炎癥中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。研究團(tuán)隊(duì)表示，未來(lái)將進(jìn)一步探索神經(jīng)刺激療法在肝臟疾病中的應(yīng)用，特別是通過(guò)調(diào)控腦-肝軸來(lái)緩解肝臟炎癥和損傷。此外，研究團(tuán)隊(duì)還將深入研究TAFA2蛋白的作用機(jī)制，開(kāi)發(fā)針對(duì)TAFA2-CCR2信號(hào)通路的靶向藥物，為肝臟疾病的治療提供更多選擇。

• 發(fā)表期刊：Cancer Cell
• 影響因子：48.8
• 發(fā)表日期：2025-2-6
• 發(fā)表單位：中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院
• 課題切入點(diǎn)：本文研究了三陰性乳腺癌（TNBC）中不同治療方案對(duì)腫瘤免疫微環(huán)境（TME）的影響，特別是探討了化療與程序性死亡配體1（PD-L1）阻斷聯(lián)合療法的細(xì)胞機(jī)制。
• 研究?材料?：研究從44名TNBC患者中獲取了78份腫瘤活檢樣本，包括接受nab-紫杉醇（Nab-PTX）聯(lián)合阿替利珠單抗（ATZ）、Nab-PTX單藥、紫杉醇（PTX）聯(lián)合ATZ以及PTX單藥治療的患者。
• 研究方法?：采用單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）和T細(xì)胞受體測(cè)序（TCR-seq）技術(shù)，對(duì)TNBC中的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)進(jìn)行了詳細(xì)分析。此外，還利用小鼠4T1乳腺癌模型進(jìn)行了體內(nèi)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，包括RNA測(cè)序和流式細(xì)胞術(shù)分析。?·?研究結(jié)論?：研究發(fā)現(xiàn)，不同治療方案下，TNBC中的免疫細(xì)胞組成發(fā)生顯著變化。Nab-PTX聯(lián)合ATZ治療顯著減少了耗竭性CD8+T細(xì)胞（Tex）的比例，同時(shí)增加了具有干細(xì)胞樣特征的中央記憶T細(xì)胞（Tcm）和效應(yīng)記憶T細(xì)胞（Tem）的比例。B細(xì)胞亞群，特別是濾泡B細(xì)胞（Bfoc），在Nab-PTX聯(lián)合ATZ治療的響應(yīng)者中顯著富集，且B細(xì)胞水平與有利反應(yīng)相關(guān)。此外，研究還揭示了不同DC亞群之間的轉(zhuǎn)化關(guān)系，以及它們與T細(xì)胞反應(yīng)之間的相互作用。肥大細(xì)胞在Nab-PTX相關(guān)治療中顯示出增加的趨勢(shì)，且其浸潤(rùn)水平與有利反應(yīng)相關(guān)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了肥大細(xì)胞激活可以增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)，從而提高PD-L1阻斷療法的有效性。

這些發(fā)現(xiàn)不僅增進(jìn)了我們對(duì)TNBC中免疫細(xì)胞動(dòng)態(tài)及其與治療反應(yīng)之間關(guān)系的理解，還為開(kāi)發(fā)新的化療免疫聯(lián)合療法提供了潛在的治療靶點(diǎn)。

• 發(fā)表期刊：Annals of Oncology
• 影響因子：56.7
• 發(fā)表日期：2025-2-4
• 發(fā)表單位：英國(guó)倫敦癌癥研究所和英國(guó)倫敦皇家馬斯登醫(yī)院
• 課題切入點(diǎn)：該研究探討了基于全基因組測(cè)序（WGS）的超靈敏循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）檢測(cè)技術(shù)在早期乳腺癌分子殘留病灶（MRD）監(jiān)測(cè)和復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)中的應(yīng)用?！?研究樣本：研究團(tuán)隊(duì)分析了78例早期乳腺癌患者（包括23例三陰性乳腺癌、35例HER2陽(yáng)性、18例HR陽(yáng)性及2例未知亞型）的617份血漿樣本，覆蓋診斷前、新輔助化療期間、術(shù)后及長(zhǎng)期隨訪（中位隨訪76個(gè)月）多個(gè)時(shí)間點(diǎn)。患者血漿樣本來(lái)自英國(guó)多家醫(yī)療中心，包括診斷前、新輔助化療周期、術(shù)后及定期隨訪樣本。
• 研究方法：對(duì)腫瘤組織進(jìn)行全基因組測(cè)序（中位深度38×），篩選高可信度體細(xì)胞變異構(gòu)建個(gè)性化檢測(cè)panel。血漿游離DNA（cfDNA）經(jīng)高通量測(cè)序后，通過(guò)分子共識(shí)算法抑制背景噪聲，計(jì)算ctDNA水平。所有樣本通過(guò)NeXT Personal MRD平臺(tái)進(jìn)行檢測(cè)，該平臺(tái)基于腫瘤組織的全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)，為每位患者個(gè)性化設(shè)計(jì)檢測(cè)panel，追蹤中位數(shù)1451個(gè)體細(xì)胞變異，檢測(cè)靈敏度可達(dá)百萬(wàn)分之一（1 PPM）。
• 數(shù)據(jù)分析：采用Kaplan-Meier生存分析和Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型評(píng)估ctDNA檢測(cè)與臨床結(jié)局（復(fù)發(fā)無(wú)生存期RFS、癌癥特異性生存期CSS）的關(guān)聯(lián)，并通過(guò)時(shí)間依賴性模型動(dòng)態(tài)評(píng)估MRD狀態(tài)對(duì)預(yù)后的影響。
• 研究結(jié)果：1. 診斷階段：98%（49/50）的患者在治療前檢測(cè)到ctDNA，涵蓋所有亞型（HER2+和TNBC均為100%，HR+為88%）。診斷時(shí)ctDNA水平升高與較差的RFS（HR=1.82）和CSS（HR=2.19）顯著相關(guān)。2. 術(shù)后監(jiān)測(cè)：所有復(fù)發(fā)患者（11/11）在臨床復(fù)發(fā)前均檢測(cè)到ctDNA（中位提前15個(gè)月），未檢測(cè)到ctDNA的患者（64/64）均未復(fù)發(fā)。術(shù)后ctDNA陽(yáng)性與RFS和CSS顯著惡化相關(guān)（均P<0.0001）。3. 靈敏度優(yōu)勢(shì)：39%的ctDNA陽(yáng)性樣本處于超低水平（<100 PPM）。與全外顯子測(cè)序（WES）和數(shù)字PCR（dPCR）相比，WGS方法在匹配樣本中檢測(cè)率更高（WGS 100% vs. WES 84% vs. dPCR 76%）。4. 動(dòng)態(tài)預(yù)后：術(shù)后6周或6個(gè)月未檢測(cè)到ctDNA的患者預(yù)后顯著改善。此外，術(shù)后早期ctDNA清除（如輔助治療后）可能提示疾病控制良好。
• 研究結(jié)論：WGS驅(qū)動(dòng)的超靈敏ctDNA檢測(cè)技術(shù)顯著提升了早期乳腺癌MRD監(jiān)測(cè)的敏感性和特異性，可提前預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)并指導(dǎo)臨床決策。其高陰性預(yù)測(cè)值（NPV 100%）支持在低風(fēng)險(xiǎn)患者中探索治療降階梯策略，而陽(yáng)性結(jié)果則為早期干預(yù)提供了依據(jù)。未來(lái)需擴(kuò)大樣本量并開(kāi)展前瞻性研究以驗(yàn)證其臨床實(shí)用性。

Ps：關(guān)注醫(yī)學(xué)領(lǐng)域腫瘤研究請(qǐng)聯(lián)系當(dāng)?shù)貥I(yè)務(wù)經(jīng)理獲取原文~

本次為各位老師帶來(lái)重慶醫(yī)科大學(xué)黃愛(ài)龍教授/唐開(kāi)福教授團(tuán)隊(duì)在nature子刊?Nature Communications?中發(fā)表的題目為“SARS-CoV-2 N protein-induced Dicer, XPO5, SRSF3, and hnRNPA3 downregulation causes pneumonia”的文章。該文章研究了 SARS-CoV-2 N 蛋白如何影響 RNA 干擾 (RNAi) 和 RNA 剪接途徑，并揭示了這些途徑在 COVID-19 發(fā)病機(jī)制中的作用，有助于開(kāi)發(fā)更有效的 SARS-CoV-2 相關(guān)肺炎治療方法。

中文題目：SARS-CoV-2 N蛋白誘導(dǎo)的Dicer、XPO5、SRSF3和hnRNPA3下調(diào)導(dǎo)致肺炎

英文題目：SARS-CoV-2 N protein-induced Dicer, XPO5, SRSF3, and hnRNPA3 downregulation causes pneumonia

發(fā)表期刊：Nature Communications?

影響因子：14.7

合作單位：重慶醫(yī)科大學(xué)

百邁客生物為該研究提供了小RNA測(cè)序和ONT全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序服務(wù)。

研究背景

2019 冠狀病毒病 （COVID-19） 由嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥冠狀病毒 2 （SARS-CoV-2） 引起，具有高度異質(zhì)性，且發(fā)病病例分布在各個(gè)年齡群體中，但重癥及死亡率明顯字老年群體比較集中。DNA 損傷是導(dǎo)致衰老的關(guān)鍵因素，也是 COVID-19 發(fā)病機(jī)制的驅(qū)動(dòng)因素，蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)喪失是衰老的另一個(gè)標(biāo)志，會(huì)導(dǎo)致不受抑制的炎性小體激活、功能失調(diào)的細(xì)胞器積累和細(xì)胞損傷，可能導(dǎo)致 COVID-19 的發(fā)病機(jī)制。Dicer 是 RNA 干擾 （RNAi） 通路的關(guān)鍵組成部分，在衰老過(guò)程中下調(diào)， RNAi 組分的敲除會(huì)導(dǎo)致 DNA 損傷，并且可能由于 miRNA的整體下調(diào)而增加蛋白質(zhì)合成，從而影響蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)，與年齡相關(guān)的剪接因子失調(diào)發(fā)生在不同生物體的多個(gè)組織中，并且與基因組穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)有關(guān)，可通過(guò)R環(huán)誘導(dǎo) DNA 損傷。然而，RNAi 成分及RNA 剪接因子在 COVID-19 發(fā)病機(jī)制中的確切作用還有待明確。

材料和方法

材料：異位表達(dá) N 蛋白的人肺癌 （A549） 和人正常肺上皮 （BEAS-2B） 細(xì)胞系 ，N 蛋白誘導(dǎo)的雄性肺損傷小鼠及正常對(duì)照 C57BL/6J 雄性小鼠；

方法：小RNA測(cè)序+ONT全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組+免疫組化+RIP等

研究結(jié)果

1.SARS-CoV-2核衣殼 （N） 蛋白誘導(dǎo)自噬降解及DNA損傷的作用機(jī)制

通過(guò)對(duì)已發(fā)表的COVID-19 患者RNA測(cè)序數(shù)據(jù)的分析，確定了重癥 COVID-19 患者 M-MDSC 中 RNAi 成分和剪接因子的 mRNA 水平低于無(wú)癥狀 COVID-19 患者，且已故 COVID-19 患者肺組織中的 RNAi 成分和剪接因子水平也低于未感染 COVID-19 的個(gè)體，表明RNAi 成分和剪接因子的表達(dá)減少與 COVID-19 感染加重有關(guān)。

細(xì)胞沉默逆轉(zhuǎn)測(cè)定使用含有內(nèi)含子的熒光素酶報(bào)告基因小基因證明了 SARS-CoV-2 抑制了該小基因的剪接。該研究從相互作用數(shù)據(jù)集的生物通用存儲(chǔ)庫(kù) （BioGRID） 中檢索了 N 蛋白的推定蛋白質(zhì)相互作用子，并用免疫共沉淀測(cè)定證實(shí)了異位表達(dá) N 蛋白的人肺癌 （A549） 和人正常肺上皮 （BEAS-2B） 細(xì)胞系中 N 蛋白與?Dicer、XPO5、SRSF3和hnRNPA3?之間的相互作用，進(jìn)一步定量測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2 感染導(dǎo)致?Dicer、XPO5、SRSF3和hnRNPA3在蛋白水平上下調(diào)，但在 mRNA 水平上不下調(diào)，而自噬抑制劑氯喹或巴弗洛霉素 A1 治療可緩解 N 蛋白或 SARS-CoV-2 誘導(dǎo)的?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?下調(diào)，用蛋白酶體抑制劑 MG132 處理并無(wú)效果，表明?N 蛋白對(duì)?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?蛋白表達(dá)的影響是自噬依賴性的。

在 BioGRID 數(shù)據(jù)庫(kù)中找到了一種自噬受體蛋白SQSTM1/p62 ，共聚焦顯微鏡分析和免疫共沉淀分析分別證實(shí)了 N 蛋白和 p62 之間的相互作用及其共定位，p62 敲低部分緩解了 N 蛋白誘導(dǎo)的?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?蛋白的下調(diào)；然而，它不會(huì)影響不表達(dá) N 蛋白的細(xì)胞中的?Dicer、XPO5、SRSF3?或?hnRNPA3?蛋白水平，表明?p62 通過(guò)與 N 蛋白的相互作用將 N 蛋白相互作用蛋白（包括?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3）募集到吞噬細(xì)胞中，導(dǎo)致自噬降解。

ATM等的磷酸化、DNA 斷裂積累等病灶形成證明了異位 N 蛋白表達(dá)或 SARS-CoV-2 感染誘導(dǎo)了 DNA 損傷，敲低?Dicer、XPO5、SRSF3?或?hnRNPA3?導(dǎo)致 DNA 損傷，而它們的過(guò)表達(dá)部分減輕了 N 蛋白誘導(dǎo)的 DNA 損傷，同時(shí)異位 N 蛋白表達(dá)或 SARS-CoV-2 感染誘導(dǎo)了 R 環(huán)積累，進(jìn)一步誘導(dǎo)DNA損傷，RNase H1（一種降解 R 環(huán)的 RNA 部分的核糖核酸內(nèi)切酶）的過(guò)表達(dá)部分減輕了這種影響并減少了 DNA 損傷積累，總的來(lái)說(shuō)，這些發(fā)現(xiàn)表明?N 蛋白誘導(dǎo)的 Dicer 、 XPO5 、 SRSF3 和 hnRNPA3 表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致 DNA 損傷。

2.SARS-CoV-2 N蛋白通過(guò)抑制 miRNA 生物發(fā)生及抑制 RNA 剪接作用機(jī)制

XPO5和Dicer在 miRNA 生物合成中起關(guān)鍵作用，小 RNA 深度測(cè)序顯示，N 蛋白誘導(dǎo) miRNA 表達(dá)的整體下調(diào)，對(duì) A549 和 BEAS-2B 細(xì)胞中表達(dá)量最高的前五個(gè) miRNA進(jìn)行定量驗(yàn)證顯示，它們?cè)诒磉_(dá) N 蛋白的細(xì)胞和 SARS-CoV-2 感染的細(xì)胞中均下調(diào)；生化分級(jí)分離實(shí)驗(yàn)顯示，異位 N 蛋白表達(dá)或 SARS-CoV-2 感染誘導(dǎo) pre-miRNA 的核保留，如細(xì)胞核中 pre-miRNA 水平的增加和細(xì)胞質(zhì)中 pre-miRNA 水平的降低所示，?XPO5過(guò)表達(dá)后得到緩解。此外，異位 N 蛋白表達(dá)或 SARS-CoV-2 感染降低了成熟 miRNA 和 pre-miRNA 之間的比率，Dicer過(guò)表達(dá)后得到緩解?？傮w而言，這些發(fā)現(xiàn)表明，N 蛋白通過(guò)降低?XPO5?表達(dá)阻斷 pre-miRNA 從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的運(yùn)輸，并通過(guò)下調(diào)?Dicer?表達(dá)抑制 pre-miRNA 向成熟 miRNA 的加工。

SRSF3或hnRNPA3敲除抑制了含有內(nèi)含子的報(bào)告基因小基因的剪接，證實(shí)了它們確實(shí)是剪接因子，而它們的過(guò)表達(dá)部分緩解了 N 蛋白或 SARS-CoV-2 感染對(duì) RNA 剪接的抑制作用，進(jìn)一步進(jìn)行全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，通過(guò)可變剪接分析發(fā)現(xiàn)，N 蛋白誘導(dǎo)內(nèi)含子保留。此外，RT-qPCR證實(shí)，異位 N 蛋白表達(dá)或 SARS-CoV-2 感染降低了一組內(nèi)源性內(nèi)含子的剪接效率，SRSF3?和?hnRNPA3?過(guò)表達(dá)部分減輕了 N 蛋白和 SARS-CoV-2 對(duì) RNA 剪接的抑制作用，這些結(jié)果表明，N 蛋白通過(guò)降低?SRSF3?和?hnRNPA3?的表達(dá)來(lái)抑制 RNA 剪接。

剪接抑制會(huì)誘導(dǎo)廣泛的 IR 和隨后的內(nèi)含子保留 mRNA 的翻譯，一部分內(nèi)含子衍生的多肽容易縮合且具有蛋白毒性，用嘌呤霉素對(duì)新生多肽進(jìn)行代謝標(biāo)記，結(jié)果顯示異位 N 蛋白表達(dá)或 SARS-CoV-2 感染誘導(dǎo)不溶性蛋白合成增加，而N蛋白與RNA的結(jié)合主要在可溶性蛋白部分被檢測(cè)到，免疫熒光檢測(cè)結(jié)果表明，N 蛋白和 SARS-CoV-2 感染誘導(dǎo)了 EGFP 聚集體的產(chǎn)生，誘導(dǎo)蛋白毒性應(yīng)激。

3.SARS-CoV-2 N 蛋白在蛋白水平的影響及動(dòng)物模型驗(yàn)證

盡管異位 N 蛋白表達(dá)或 SARS-CoV-2 感染導(dǎo)致 4EBP1 去磷酸化，但它增加了整體蛋白質(zhì)合成，而沒(méi)有顯著影響 S6K1 磷酸化，對(duì)照組的刺突蛋白和膜蛋白對(duì)整體蛋白質(zhì)合成沒(méi)有影響，而包膜蛋白甚至抑制了整體蛋白質(zhì)合成，Dicer?或?XPO5?敲低導(dǎo)致 JNK 激活和 4EBP1 去磷酸化，同時(shí)略微增加 S6K1 磷酸化并促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，表明 N 蛋白通過(guò)降低?Dicer?和?XPO5?表達(dá)來(lái)促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，并通過(guò)下調(diào)?SRSF3?和?hnRNPA3?表達(dá)來(lái)抑制蛋白質(zhì)合成。由于?Dicer?和?XPO5?的下調(diào)比?SRSF3?和?hnRNPA3?的下調(diào)更顯著地促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，因此 N 蛋白最終增強(qiáng)了蛋白質(zhì)合成。

小鼠體內(nèi)驗(yàn)證結(jié)果顯示， N 蛋白在小鼠肺組織中的表達(dá)導(dǎo)致?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?下調(diào)、DNA 損傷、胞質(zhì) DNA 積累、細(xì)胞凋亡、IFNβ、IL-6 和 NKG2D 配體上調(diào)，以及伴有明顯巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)的肺炎，肺組織中?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?敲低導(dǎo)致肺損傷和肺炎，而它們的過(guò)表達(dá)部分緩解了 N 蛋白誘導(dǎo)的肺炎，這些結(jié)果表明，N 蛋白誘導(dǎo)的?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?蛋白表達(dá)下調(diào)是 SARS-CoV-2 誘導(dǎo)肺炎的一種機(jī)制。

分析已發(fā)表的 3、6、12 和 24 個(gè)月齡 C57BL/6J 小鼠肺組織的 RNA 測(cè)序數(shù)據(jù)，在 8 周齡和 18 個(gè)月齡 C57BL/6J 小鼠的 mRNA 和蛋白質(zhì)水平上證實(shí)了肺組織中?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?的年齡依賴性下調(diào)， DNA 損傷、細(xì)胞凋亡等功能在老年小鼠中明顯富集，結(jié)合Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?敲低實(shí)驗(yàn)，表明，Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?的年齡相關(guān)下調(diào)與 N 蛋白誘導(dǎo)的肺炎嚴(yán)重程度增加有關(guān)。

PJ34 是一種（ADP-核糖）聚合酶 （PARP） 抑制劑，免疫沉淀結(jié)果表明 PJ34 通過(guò)阻止 N 蛋白誘導(dǎo)的?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?的下調(diào)來(lái)緩解肺炎，阿那曲唑是一種增強(qiáng) Dicer 表達(dá)的芳香化酶抑制劑，WB結(jié)果表明，阿那曲唑通過(guò)促進(jìn)?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?的表達(dá)來(lái)緩解 SARS-CoV-2 N 蛋白誘導(dǎo)的肺炎。

思路發(fā)散

本研究通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索及分子實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證先初步推測(cè)SARS-CoV-2 N蛋白的年齡依賴調(diào)控機(jī)制與RNAi以及可變剪接相關(guān)，之后通過(guò)組學(xué)測(cè)序在整體水平上驗(yàn)證了猜測(cè)并進(jìn)一步細(xì)化了調(diào)控方式，之后再通過(guò)大量過(guò)表達(dá)及敲降后對(duì)應(yīng)分子在RNA及蛋白水平的定量驗(yàn)證了結(jié)果，是一個(gè)比較經(jīng)典有效的實(shí)驗(yàn)思路，可以在其他實(shí)驗(yàn)中參考。

參考文獻(xiàn)：

Luo YW, Zhou JP, Ji H, Xu D, Zheng A, Wang X, Dai Z, Luo Z, Cao F, Wang XY,Bai Y, Chen D, Chen Y, Wang Q, Yang Y, Zhang X, Chiu S, Peng X, Huang AL, Tang KF. SARS-CoV-2 N protein-induced Dicer, XPO5, SRSF3, and hnRNPA3 downregulation causes pneumonia.?Nat Commun. 2024 Aug 13;15(1):6964. doi:10.1038/s41467-024-51192-1.

本期為各位老師帶來(lái)一篇關(guān)于小RNA及l(fā)ncRNA研究的高分經(jīng)典案例解讀，希望能為各位老師后續(xù)研究激發(fā)新的研究思路~

中文題目：Klotho衍生肽1通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控恢復(fù)Klotho表達(dá)抑制纖維化腎臟細(xì)胞衰老

英文題目：Klotho-derived peptide 1 inhibits cellular senescence in the fibrotic kidney by restoring Klotho expression via posttranscriptional regulation[2]

合作單位：南方醫(yī)科大學(xué)

發(fā)表期刊：Theranostics?

影響因子：12.4

百邁客生物為該研究提供了miRNA測(cè)序服務(wù)。

研究背景

慢性腎?。–KD）是一種持續(xù) 3 個(gè)月以上的腎功能不全病癥，特征通常是細(xì)胞衰老增加、表觀遺傳重編程、持續(xù)的成纖維細(xì)胞活化和持續(xù)的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）產(chǎn)生，與老年腎臟存在很多相似之處，因此，CKD現(xiàn)在被認(rèn)為是一種腎臟過(guò)早和加速衰老的狀態(tài)?？顾ダ系鞍?Klotho 屬于由α和β亞型組成的單跨膜蛋白小家族，腎損傷會(huì)導(dǎo)致Klotho表達(dá)下調(diào)，Klotho 缺乏可導(dǎo)致高磷血癥、腎小管細(xì)胞衰老和腎纖維化等，進(jìn)一步加速 CKD的進(jìn)展，因此Klotho 被認(rèn)為是腎臟疾病診斷和預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

然而由于Klotho 是一種大型跨膜蛋白，臨床生產(chǎn)成本高且難度大，因此作者團(tuán)隊(duì)在前期報(bào)道了Klotho衍生肽1（KP1） 的發(fā)現(xiàn)，可通過(guò)結(jié)合TGF-β 受體2（TβR2） 并抑制 TGF-β/Smad3 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)減輕腎纖維化，且生產(chǎn)上會(huì)更便捷經(jīng)濟(jì)，有可能替代 Klotho 進(jìn)行臨床轉(zhuǎn)化，為了進(jìn)一步研究 KP1 在保護(hù)腎臟中的作用，作者在本篇研究中檢查了其對(duì)細(xì)胞衰老的影響。

材料方法

材料：8-10周齡雄性C57BL/6小鼠假手術(shù)組（sham）、單側(cè)缺血再灌注損傷（UIRI）組別小鼠和治療組別小鼠（UIRI + KP1）共三組小鼠腎臟組織；

方法：miRNA測(cè)序+雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)+RNA 熒光原位雜交等

研究結(jié)果

WB檢測(cè)了許多細(xì)胞衰老標(biāo)志物如p21、p16和γ-H2AX的表達(dá)，結(jié)果表明了UIRI 誘導(dǎo)纖維化腎中對(duì)應(yīng)標(biāo)志物的表達(dá)，而KP1明顯消除了這種誘導(dǎo)。此外針對(duì)其內(nèi)源Klotho 的檢測(cè)也證明UIRI 導(dǎo)致腎臟中Klotho 的丟失而KP1在很大程度上恢復(fù)了它們的表達(dá)，單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）誘導(dǎo)的 CKD 模型以及體外細(xì)胞模型中也出現(xiàn)了類似的結(jié)果，此外，UIRI 還導(dǎo)致 Klotho mRNA 的顯著下調(diào)。然而，KP1 不影響 Klotho mRNA 的穩(wěn)態(tài)水平，說(shuō)明KP1通過(guò)獨(dú)立于轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)制誘導(dǎo) Klotho。

此外，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行的細(xì)胞周期分析表明，TGF-β1 孵育后的衰老原代腎小管細(xì)胞停滯在 G1 期，這被 KP1 處理抵消，證明了KP1阻斷細(xì)胞衰老的能力，而在可以阻斷新mRNA合成的放線菌素D（ActD）存在下與 TGF-β1 孵育后 12 小時(shí)和 24 小時(shí)，KP1 不會(huì)影響 Klotho mRNA 水平，進(jìn)一步證實(shí)了 KP1 誘導(dǎo) Klotho 蛋白表達(dá)而不影響其mRNA和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。

由于 KP1 不影響 Klotho mRNA 水平和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，作者開(kāi)始探索 KP1 是否通過(guò)miRNA調(diào)節(jié) Klotho 蛋白，在 UIRI 腎臟中鑒定到了68個(gè)上調(diào)miRNA，在注射 KP1 后恢復(fù)到基線，其中 10 個(gè)與 Klotho mRNA 的 3′-UTR 特異性結(jié)合，其中miR-223-3p表現(xiàn)非常明顯，且在對(duì)公共轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集分析后發(fā)現(xiàn)，miR-223-3p 與 Klotho 水平呈負(fù)相關(guān)，支持了 miR-223-3p 與 Klotho 調(diào)節(jié)的相關(guān)性。

為了證實(shí) miR-223-3p 在 Klotho 表達(dá)中的調(diào)節(jié)作用，作者進(jìn)行了雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定，轉(zhuǎn)染 miR-223-3p 模擬物降低了含有野生型未突變型 Klotho mRNA 序列的報(bào)告基因的熒光素酶活性，表明 miR-223-3p 可以特異性靶向 Klotho mRNA，抑制其活性，用miR-223-3p轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞進(jìn)一步證明miR-223-3p抑制 HK-2 細(xì)胞中 Klotho 蛋白的表達(dá)。體內(nèi)模型原位雜交驗(yàn)證了miR-223-3p 在 UIRI 腎腎小管上皮中被誘導(dǎo)，而KP1抑制了miR-223-3p表達(dá)，結(jié)合免疫熒光染色結(jié)果證明了KP1 可以通過(guò)在體內(nèi)抑制 miR-223-3p 來(lái)恢復(fù) Klotho 表達(dá)，在體外的HK-2 細(xì)胞中的miR-223-3p及其拮抗劑轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)也呈現(xiàn)出了相同的結(jié)果。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果，作者對(duì)小鼠模型靜脈注釋miR-223-3p 表達(dá)質(zhì)粒和 KP1構(gòu)建體內(nèi)表達(dá)模型，結(jié)果顯示，miR-223-3p 的過(guò)表達(dá)加劇了 p16 、 γ-H2AX 、纖連蛋白、 I 型膠原和 α-SMA 的表達(dá)，所有這些都被 KP1 抑制，而miR-223-3p拮抗素的注射同樣消除了 UIRI 小鼠中的 p21、p16 和 γ-H2AX、纖連蛋白、膠原蛋白 I 和 α-SMA，恢復(fù)了腎功能。而 KP1、SB431542 （TβR1/2 抑制劑） 和 SIS3 （p-Smad3 抑制劑） 處理 TGF-β1 刺激的 HK-2 細(xì)胞結(jié)果進(jìn)一步闡明了，KP1 通過(guò)阻斷 TGF-β1/Smad3/miR-223-3p 信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)恢復(fù) Klotho 表達(dá)并防止細(xì)胞衰老。

由于 miRNAs 和 lncRNAs 經(jīng)常相互作用并相互調(diào)節(jié)，作者搜索了幾個(gè) lncRNA-miRNA 相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)，并預(yù)測(cè) miR-223-3p 和 lncRNA-TUG1 （牛磺酸上調(diào)基因 1） 具有推定的結(jié)合位點(diǎn)，雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定驗(yàn)證了miR-223-3p 降低了野生型TUG1報(bào)告基因的熒光素酶活性，且在 HK-2 細(xì)胞中過(guò)表達(dá) miR-223-3p 抑制了 lncRNA-TUG1，而KP1則消除了這個(gè)效果，TGF-β1抑制了HK-2細(xì)胞中l(wèi)ncRNA-TUG1的表達(dá)，而KP1、SB43154或SIS3則消除了此類效果，這些結(jié)果表明lncRNA-TUG1受TGF-β/Smad信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)。而LncRNA-TUG1 沉默也降低了 Klotho 蛋白，但沒(méi)有降低其 mRNA 水平，說(shuō)明miR-223-3p 可以與 lncRNA-TUG1 相互作用，形成競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性 RNA （ceRNA） 網(wǎng)絡(luò)，從而放大其在調(diào)節(jié) Klotho 表達(dá)和細(xì)胞衰老中的作用。體內(nèi)UUO和UIRI 模型中都驗(yàn)證了這一點(diǎn)。

綜上所述，miR-223-3p 和 lncRNA-TUG1 協(xié)同工作，導(dǎo)致 Klotho 丟失、細(xì)胞衰老和腎纖維化，所有這些都被 KP1 緩解。KP1 是一種新發(fā)現(xiàn)的 Klotho 衍生肽，通過(guò)恢復(fù) Klotho 表達(dá)來(lái)抑制細(xì)胞衰老，KP1 的這種作用由 miR-223-3p 和 lncRNA-TUG1 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)運(yùn)作。通過(guò)恢復(fù) Klotho 表達(dá)，KP1 充當(dāng) Klotho 誘導(dǎo)劑，并具有廣泛的腎保護(hù)特性，例如抗氧化、抗衰老和干細(xì)胞保護(hù)，有望將KP1轉(zhuǎn)化為 CKD 患者的臨床治療。

思路發(fā)散

本研究中利用miRNA測(cè)序、公共lncRNA數(shù)據(jù)庫(kù)以及公共轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集共同分析出了miRNA與lncRNA共同構(gòu)建ceRNA網(wǎng)絡(luò)在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控蛋白表達(dá)的作用機(jī)制，對(duì)于較新的研究來(lái)說(shuō)，可以直接通過(guò)全轉(zhuǎn)錄組，利用同一來(lái)源組織構(gòu)建兩個(gè)文庫(kù)（lncRNA及小RNA文庫(kù)）得到包括lncRNA、miRNA、mRNA以及circRNA的結(jié)果，由此可分析出更可靠的相關(guān)性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，便于篩選關(guān)鍵非編碼RNA。

參考文獻(xiàn)：

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[2] Zhang X, Li L, Tan H, Hong X, Yuan Q, Hou FF, Zhou L, Liu Y. Klotho-derived peptide 1 inhibits cellular senescence in the fibrotic kidney by restoring Klotho expression via posttranscriptional regulation. Theranostics. 2024 Jan 1;14(1):420-435. doi: 10.7150/thno.89105. PMID: 38164143; PMCID: PMC10750200.

期刊名稱：cell proliferation.

影響因子：5.9

合作單位：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院

研究部位：大鼠胚胎

研究方法：空間轉(zhuǎn)錄組、免疫熒光、CCK-8、WB、ROS檢測(cè)等

百邁客生物為該研究提供了空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序服務(wù)。

研究背景

肛門直腸畸形 （ARM） 是兒童常見(jiàn)的先天性消化道畸形，發(fā)病率為 1/5000。ARM 的病因仍然難以捉摸，其發(fā)病機(jī)制與遺傳和環(huán)境因素有關(guān)。最近的研究強(qiáng)調(diào)了遺傳調(diào)控在這一過(guò)程中的關(guān)鍵作用。ARM 通常發(fā)生在妊娠 4-8 周，主要在出生后診斷，通常需要手術(shù)干預(yù)作為治療。然而，ARM 患者的長(zhǎng)期術(shù)后結(jié)局并不理想，通常會(huì)導(dǎo)致并發(fā)癥，例如大便失禁和慢性便秘。這些并發(fā)癥對(duì)受影響兒童的生活質(zhì)量和社會(huì)心理發(fā)展有重大影響。作者的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析確定了鐵死亡的發(fā)生，這是一種鐵依賴性的程序性細(xì)胞死亡，其特征是活性氧 （ROS） 和脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物在 ARM 后腸內(nèi)積累。作者假設(shè)這個(gè)過(guò)程受活化 C 激酶受體 1 （Rack1） 的調(diào)節(jié)，細(xì)胞質(zhì)蛋白與鳥(niǎo)嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白有相似之處。它在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、信號(hào)傳導(dǎo)和免疫反應(yīng)中發(fā)揮著多種作用，并且在胚胎神經(jīng)發(fā)育中具有潛在的意義。然而，以前的研究沒(méi)有報(bào)道 Rack1 在鐵死亡調(diào)節(jié)中的作用。因此，它在胚胎消化道發(fā)育和 ARM 形成中的作用需要進(jìn)一步探索。

材料方法

使用Wistar 大鼠，在 ARM 組中，大鼠在 GD 10開(kāi)始口服 1% ETU 125 mL/kg，對(duì)照組接受等劑量生理鹽水。從 GDs 14-16取胚胎。

1、空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序剖宮產(chǎn)后，立即將取出的胚胎置于冷生理鹽水中以去除表面血。將胚胎以水平矢狀方向放置在含有預(yù)冷OCT的包埋盒中儲(chǔ)存在 -80°C 冰箱中。共計(jì)6份樣品，切片包括尿道和后腸層。2、免疫熒光

選擇清晰全面顯示尿道、后腸、URS 和尿道回瘺的石蠟切片進(jìn)行染色。

研究結(jié)果

1.空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的注釋聚類

在這項(xiàng)研究中，作者在 GDs 14-16 （稱為 N14-16） 上使用正常的 Wistar 大鼠胚胎，在 GDs 14-16 （稱為 A14-16） 上使用 ETU 誘導(dǎo)的 ARM 胚胎進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。制備大鼠胚胎的 6 個(gè)冷凍中矢狀切片，每個(gè) 10 μm 厚。這些切片包括尿道和后腸層，提供了特定時(shí)間點(diǎn)泄殖腔發(fā)育的全面視圖（圖 1A）。使用 10× Genomics Visium 空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，然后進(jìn)行組織透化、cDNA 合成和文庫(kù)構(gòu)建，作者成功地捕獲了正常和 ARM 胚胎中的視覺(jué)基因轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)，主要來(lái)自泄殖腔區(qū)域。為了確保來(lái)自同一區(qū)域的各種切片樣本之間的可比性和一致性，作者進(jìn)行了聚類注釋，產(chǎn)生了七個(gè)不同的聚類。這些集群包括泄殖腔區(qū)域內(nèi)的五個(gè)特定區(qū)域（集群 0-4），即尿道、后腸、膀胱、URS 和生殖器結(jié)節(jié)。此外，兩個(gè)簇 （簇 5 和 6） 對(duì)應(yīng)于椎體和神經(jīng)管區(qū)域 （圖 1A）。平均而言，每個(gè)解剖區(qū)域覆蓋 3005 個(gè)點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)捕獲 16,905 個(gè)基因（圖 1B）。

圖1-空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的注釋聚類

2.正常組和 ARM 組之間的 DEG 篩選

鑒定 DEG 的標(biāo)準(zhǔn)被確定為絕對(duì)對(duì)數(shù)2 倍變化 （|log2FC|） ≥ 0.58 且顯著性水平為 p< 0.05. 這種篩選導(dǎo)致了差異火山圖的創(chuàng)建，以說(shuō)明基因表達(dá)的改變。在 GDs 14、15 和 16 的后腸發(fā)育背景下，作者分別鑒定了 91、439 和 119 個(gè)基因，它們?cè)谶@些時(shí)間點(diǎn)表現(xiàn)出不同的表達(dá)譜（圖 1C）。值得注意的是，Rack1 （Gnb2l1） 在 GDs 15 和 16 上在 ARM 組后腸內(nèi)的表達(dá)降低。為了進(jìn)一步探索潛在的分子相互作用，作者進(jìn)行了全面的 PPI 分析。通過(guò)利用 BC 值作為排名標(biāo)準(zhǔn)，作者突出了最顯著的差異表達(dá)后腸基因（圖 1D）。樞紐基因，在環(huán)狀排列中用粉紅色節(jié)點(diǎn)表示，包括 Uba52、Rack1 和 Tpt1，在后腸發(fā)育的 GDs 15 和 16 期間，每個(gè)基因在基因網(wǎng)絡(luò)中都具有顯著的中心性。值得注意的是，Rack1 表現(xiàn)出卓越的連通性，在 GD 15 和 16 的 PPI 網(wǎng)絡(luò)中躋身前五名基因之列。

3.在 GD 15 上驗(yàn)證后腸部分 DEGs

圖 2A-E 全面說(shuō)明了 GD15 截面泄殖腔區(qū)域中前五個(gè)基因的蛋白質(zhì)表達(dá)模式和定位：Rack1、Npm1、Eef1b2、Uba52?和?Tpt1。這些數(shù)字是使用免疫熒光染色獲得的。值得注意的是，這 5 種蛋白質(zhì)在 N15 泄殖腔區(qū)域的尿道和后腸上皮內(nèi)均表現(xiàn)出位點(diǎn)特異性表達(dá)。除?Tpt1?外，其他 4 種蛋白在 AM 區(qū)域內(nèi)表現(xiàn)出表達(dá)水平升高。此外，觀察到這些蛋白質(zhì)離散分布在 URS 的下肢和后腸的間質(zhì)附近。相比之下，這五種蛋白的表達(dá)在 A15 泄殖腔區(qū)域的尿道和后腸上皮內(nèi)明顯下降，伴隨著尿道直瘺部位的表達(dá)水平降低 （p < 0.05）。圖 2F 顯示了平均光密度 （AOD） 的半定量評(píng)估，特別是在后腸結(jié)構(gòu)域內(nèi)。

圖2-在 GD 15 上驗(yàn)證后腸部分 DEGs

4.PROGENy 算法預(yù)測(cè)后腸中 MAPK 信號(hào)通路的集中富集

PROGENy 算法用于通過(guò)下游基因表達(dá)的變化評(píng)估信號(hào)通路的活性。作者獲得了正常組和 ARM 組 GDs 14-16 樣本中不同通路的活性水平評(píng)分。在使用 NNMF 對(duì)后腸區(qū)域（N14 因子 16、A14 因子 15、N15 因子 15、A15 因子 20、N16 因子 18 和 A16 因子 10）進(jìn)行聚類分析中，PROGENy 算法顯示與 MAPK 信號(hào)通路呈強(qiáng)正相關(guān)，表明 MAPK 信號(hào)在后腸中顯著富集（圖 3A)。從這些區(qū)域提取來(lái)自 Erk、P38、JNK 和 Erk5 家族的 12 個(gè)成員分子的定位表達(dá)模式。具體來(lái)說(shuō)，Mapk3 、 Mapk6 和 Mapk14 主要富集在泄殖腔區(qū)域。這些蛋白質(zhì)的免疫熒光驗(yàn)證證實(shí)了它們?cè)谀虻篮秃竽c區(qū)域的特異性表達(dá)，在 URS 和間質(zhì)區(qū)域的表達(dá)相對(duì)較弱，這與 PROGENy 預(yù)測(cè)一致（圖 3B）。

圖3-PROGENy 算法預(yù)測(cè)后腸中 MAPK 信號(hào)通路的集中富集用

5.通過(guò)細(xì)胞死亡基因定位探索 Gpx4 的時(shí)空表達(dá)模式

在基因集富集分析（GSEA）數(shù)據(jù)庫(kù)中，細(xì)胞死亡基因集包含161個(gè)基因，其中 7 個(gè)細(xì)胞死亡相關(guān)基因是從基因集與GD 15上簇1中的 DEGs 交集中獲得的（圖 4A）。圓形熱圖顯示了與聚類1的6個(gè)樣本相同區(qū)域內(nèi)的細(xì)胞死亡基因的表達(dá)譜。值得注意的是，發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶家族的關(guān)鍵成員?Gpx4?在 GD 15 的簇 1 中下調(diào)（p < 0.05；圖 4B）。免疫熒光染色顯示 Gpx4 蛋白在尿道和后腸上皮以及 AM 區(qū)域的顯著定位，在 URS 中觀察到的分布相對(duì)較淺。在 ARM 組的泄殖腔中觀察到 Gpx4 陽(yáng)性信號(hào)的減少（圖 4C）。AOD 分析表明，在 GDs 15 和 16 上，后腸中 Gpx4 表達(dá)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著降低（p < 0.05;圖 4D）。

圖4-通過(guò)細(xì)胞死亡基因定位探索 Gpx4 的時(shí)空表達(dá)模式

6.PD-L2 過(guò)表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞凋亡并促進(jìn)對(duì) EGFR-TKI 的耐藥

N15 胚胎石蠟切片的雙免疫熒光染色顯示 Rack1 和 Gpx4 蛋白在尿道和后腸上皮內(nèi)共定位。該結(jié)果表明 Rack1 在調(diào)節(jié)這些組織中的鐵死亡中的潛在作用 （圖 4E）。隨后，進(jìn)行顯微解剖以獲得正常和 ARM 胚胎的后腸組織。透射電子顯微鏡 （TEM） 顯示 ARM 組細(xì)胞線粒體體積減小，線粒體密度增加，線粒體嵴減少。這些觀察結(jié)果與與鐵死亡發(fā)生相關(guān)的線粒體形態(tài)變化一致（圖 4F）。

7.Rack1 在 GDs 14 和 16 上的時(shí)空表達(dá)譜

之前描述了 Rack1 蛋白在 GD 15 泄殖腔區(qū)的定位（圖 2A），作者進(jìn)一步研究了它在 GDs 14 和 16 泄殖腔區(qū)的定位。在正常胚胎 （N14） 中，Rack1 陽(yáng)性信號(hào)主要在尿道和后腸的上皮細(xì)胞中觀察到，后腸遠(yuǎn)端的濃度較高。這些信號(hào)也分散在 URS 和間充質(zhì)細(xì)胞內(nèi)。在 ARM 胚胎 （A14） 中，在 URS 尖端、后腸和尿道上皮觀察到 Rack1 陽(yáng)性細(xì)胞（圖 5A）。比較分析顯示，N14 和 A14 組之間 Rack1 陽(yáng)性信號(hào)的 AOD 沒(méi)有顯著差異（圖 5B）。在 GD 16 （N16） 的正常大鼠胚胎中，Rack1 表達(dá)在尿道和后腸上皮中仍然突出，但在 URS 和周圍間充質(zhì)區(qū)域受到限制（圖 5A）。值得注意的是，A16 后腸區(qū)域的熒光強(qiáng)度降低 （p < 0.05），如圖 5B 所示，這說(shuō)明了后腸區(qū)域的半定量 AOD 結(jié)果。

圖5-Rack1 在 GDs 14 和 16 上的時(shí)空表達(dá)譜

8.敲低 Rack1 誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞鐵死亡

在 IEC-6 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染 si-Rack1 后，使用 TEM 觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。si-Rack1 組表現(xiàn)出完整的細(xì)胞和核膜，線粒體大小減小，線粒體密度增加。此外，線粒體嵴減少或不存在，類似于 erastin 處理后觀察到的特征（圖 5C）。如 CCK-8 測(cè)定中觀察到的 Rack1 敲低導(dǎo)致細(xì)胞活力降低，LDH 測(cè)定所示，細(xì)胞毒性增加（p < 0.05；圖 5D）。使用 FerroOrange 探針的熒光分析表明 si-Rack1 組細(xì)胞內(nèi)亞鐵離子濃度升高，在 Fer-1 處理后降低（p < 0.05；圖 5E）。使用 DCFH-DA 探針測(cè)量細(xì)胞內(nèi) ROS 水平顯示 si-Rack1 組的 ROS 水平較高，在 Fer-1 處理后下降（p < 0.05；圖 5F）。Liperfluo 探針評(píng)估揭示了 Fer-1 能夠減輕 si-Rack1 組中升高的脂質(zhì)過(guò)氧化物水平 （p < 0.05；圖 5G）。熒光強(qiáng)度定量結(jié)果如右圖所示。

9.Rack1 敲低可增強(qiáng) P38 磷酸化并調(diào)節(jié)下游 Nqo1/Gpx4 表達(dá)

如前所述，MAPK 信號(hào)通路在后腸區(qū)域顯著富集（圖 3A）。在 IEC-6 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染 si-Rack1 后，使用 MAPK 信號(hào)通路 PCR 陣列在 mRNA 水平上鑒定受 Rack1 影響的下游分子。使用閾值 |log2FC|≥ 2 和 p < 0.05 用于 PCR 陣列差異基因篩選，作者觀察到 si-Rack1 組中 P38δ （Mapk13 encoding） 的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著升高（圖 6A、B）。Western blot 分析顯示，Rack1 敲低后磷酸化 P38 水平增加（圖 6C、D），表明對(duì) Rack1 的干擾增強(qiáng)了 P38 磷酸化，從而激活了 IEC-6 細(xì)胞中的 P38-MAPK 信號(hào)通路。隨后，使用鐵死亡 PCR 陣列篩選 si-Rack1 和 doramapimod 處理組之間表現(xiàn)出 mRNA 水平變化的基因，揭示了總共 7 個(gè)基因（圖 6E）。此外，這 7 個(gè)基因的表達(dá)豐度數(shù)據(jù)與現(xiàn)有研究報(bào)告相結(jié)合，將 Nqo1 確定為下游分子，以供進(jìn)一步研究。Western blotting 分析顯示，doramapimod 處理逆轉(zhuǎn)了 Rack1 敲除誘導(dǎo)的 Nqo1 蛋白水平降低（圖 6F）。此外，在 si-Rack1 組中觀察到的 Gpx4 降低被 doramapimod 抑制，并通過(guò) 2-HBA 處理恢復(fù)（圖 6G）。

圖6-Rack1 敲低可增強(qiáng) P38 磷酸化并調(diào)節(jié)下游 Nqo1/Gpx4 表達(dá)

10.Rack1?通過(guò) P38 和 Nqo1 介導(dǎo)腸上皮細(xì)胞中的鐵死亡

在 IEC-6 細(xì)胞敲低 Rack1 的同時(shí)，使用 doramapimod 和 2-HBA 進(jìn)行拯救實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，與單獨(dú)的 Rack1 敲低相比，添加 doramapimod 和 2-HBA 導(dǎo)致細(xì)胞活力增加和相對(duì) LDH 含量降低 （p < 0.05；圖 6H，I）。此外，在添加 doramapimod 和 2-HBA 后，細(xì)胞內(nèi)亞鐵離子濃度降低，同時(shí) ROS 和脂質(zhì)過(guò)氧化水平降低（p < 0.05；圖 6J-L）。這些發(fā)現(xiàn)表明，Rack1 通過(guò)P38信號(hào)通路和 Nqo1 調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鐵含量和脂質(zhì)過(guò)氧化，從而介導(dǎo)腸上皮細(xì)胞的鐵死亡。

研究總結(jié)

本研究利用空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)對(duì) GDs 14-16 期間的正常和 ARM 大鼠胚胎樣本進(jìn)行測(cè)序。作者在后腸區(qū)域鑒定了具有高連接性的新樞紐基因，即?Rack1 、 Uba52 、 Tpt1 、 Npm1?和?Eef1b2。相比之下，作者觀察到 MAPK 信號(hào)通路的顯著富集和 Gpx4 在后腸區(qū)域的差異表達(dá)。值得注意的是，Rack1?在 GDs 15 和 16 的 ARM 后腸中表達(dá)降低，通過(guò) P38/Nqo1/Gpx4 軸升高細(xì)胞內(nèi)鐵、ROS 和脂質(zhì)過(guò)氧化水平，最終誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞鐵死亡，并可能影響 ARM 后腸發(fā)育。這些發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)了作者對(duì) ARM 發(fā)病機(jī)制的理解，并對(duì)推進(jìn) ARM 產(chǎn)前診斷和治療策略的研究具有重要意義。

2024年5月，沈陽(yáng)藥科大學(xué)在國(guó)際學(xué)術(shù)期刊cell death & differentiation 發(fā)表一項(xiàng)重要研究成果，題為：PD-L2 drives resistance to EGFR-TKIs: dynamic changes of the tumor immune environment and targeted therapy。使用單細(xì)胞 RNA 測(cè)序 (scRNA-seq)、TUNEL、酶聯(lián)免疫吸附、流式細(xì)胞術(shù)、WB、CETSA、CCK-8來(lái)剖析腫瘤的耐藥機(jī)制。

期刊名稱：cell death & differentiation.

影響因子：13.7

合作單位：沈陽(yáng)藥科大學(xué)

研究部位：小鼠異種移植腫瘤

研究方法：scRNA-seq、TUNEL、酶聯(lián)免疫吸附、流式細(xì)胞術(shù)、WB、HTRF、CCK-8

百邁客生物為該研究提供了單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)服務(wù)。

表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑 （EGFR-TKI） 是癌癥靶向治療的經(jīng)典例子。已獲批的 EGFR-TKIs 單獨(dú)使用或與化療聯(lián)合用于治療非小細(xì)胞肺癌 （NSCLC）、結(jié)直腸癌 （CRC）、乳腺癌 （BC） 等。然而，大多數(shù)患者在 1-2 年后對(duì) EGFR-TKI 產(chǎn)生獲得性耐藥，隨后癌癥復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。為了解決這一緊迫的臨床問(wèn)題，迫切需要延遲和克服 EGFR-TKIs 耐藥的策略。到目前為止，獲得性 EGFR 突變、MET 擴(kuò)增、ERBB2 擴(kuò)增和旁路激活等作為 EGFR-TKI 耐藥的機(jī)制已得到充分研究。近年來(lái)，一些研究人員開(kāi)始關(guān)注腫瘤免疫環(huán)境狀態(tài)與 EGFR-TKIs 治療療效之間的關(guān)系。臨床研究最近發(fā)現(xiàn)，EGFR-TKIs 治療可以重塑腫瘤免疫環(huán)境，但 EGFR-TKIs 與瘤周免疫細(xì)胞之間的關(guān)系尚未得到充分研究。

使用攜帶 EGFR 突變的小鼠細(xì)胞系建立了異位異種移植腫瘤模型，并評(píng)估了對(duì)不同代 EGFR-TKI 的反應(yīng)，揭示腫瘤耐藥機(jī)制。

進(jìn)行天然小分子化合物庫(kù) （MCE） 的篩選，制作了 266 個(gè)樣品。篩選 PD-1/PD-L2 結(jié)合抑制劑。

• 腫瘤免疫環(huán)境參與腫瘤對(duì) EGFR-TKIs 的耐藥性

首先，該研究使用攜帶 EGFR 突變的小鼠細(xì)胞系建立了異位異種移植腫瘤模型，并評(píng)估了對(duì)不同代 EGFR-TKI 的反應(yīng)。EGFR 突變或擴(kuò)增存在于多種癌癥中，如非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌等。EGFR-TKIs 可以靶向 EGFR 敏感突變。因此，作者使用小鼠肺腺癌細(xì)胞 （LLC） 和結(jié)直腸癌細(xì)胞 （CT26） 作為工具細(xì)胞。作者用突變形式的人 EGFR 轉(zhuǎn)染小鼠細(xì)胞系 （LLC 和 CT26），攜帶外顯子 19 缺失 （EGFR19del） 或外顯子 21 L858R 錯(cuò)義突變 （EGFRL858R），這會(huì)增加 EGFR 活性，以接近細(xì)胞模型到人類疾病，建立同基因荷瘤小鼠模型。在轉(zhuǎn)染 EGFR 突變體的細(xì)胞中，p-EGFR 和 p-ERK1/2 的表達(dá)增強(qiáng)，增殖速率顯著增加，表明細(xì)胞 EGFR 下游信號(hào)通路激活（圖 1A、B）。正如預(yù)期的那樣，EGFR 突變細(xì)胞對(duì)不同代 EGFR-TKI 更敏感，包括厄洛替尼、阿法替尼和奧希替尼（圖 1B）。為了全面探討 EGFR-TKIs 耐藥的機(jī)制，作者使用 EGFR 突變細(xì)胞建立了第一代和第三代 EGFR-TKIs 耐藥同基因小鼠模型（圖1C）。如圖1 D所示，第一代 （P1） LLC-EGFR19del 來(lái)源的腫瘤對(duì)奧希替尼敏感 （抑制率 = 44.0%）。在第 2 代 （P2） 中，作者將奧希替尼的劑量增加了一倍，腫瘤抑制率降低了一半 （22.2%）。用奧希替尼治療的第三代 （P3） LLC-EGFR19del衍生腫瘤被認(rèn)為對(duì)奧希替尼耐藥，因?yàn)樗鼈兊捏w積與用生理鹽水治療的小鼠的體積沒(méi)有顯著差異。同時(shí)，作者還使用類似的方法成功獲得了對(duì)奧希替尼耐藥的 LLC-EGFRL858R衍生腫瘤和對(duì)厄洛替尼耐藥的 CT26-EGFR19del衍生腫瘤（圖 1D）。

為了進(jìn)一步研究 EGFR-TKIs 耐藥與腫瘤免疫微環(huán)境之間的關(guān)系，作者將 P3 CT26-EGFR19del衍生的腫瘤接種到免疫功能正常的 BALB/c 小鼠和嚴(yán)重免疫缺陷的 NOD （PRKDCKO?IL2RKO） 小鼠中，然后作者評(píng)估了它們對(duì)厄洛替尼的反應(yīng)性（圖 1E）。作者的結(jié)果表明，接種到 BALB/c 小鼠中的腫瘤對(duì)厄洛替尼治療保持耐藥性（抑制率 = 6.9%），而接種到 NOD （PRKDCKO?IL2RKO） 小鼠中的腫瘤顯示出降低的耐藥性（抑制率 = 40.2%）（圖1E）。與體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)數(shù)據(jù)一致，增殖生物標(biāo)志物 Ki67 的表達(dá)在用厄洛替尼處理后也顯示免疫缺陷異種移植腫瘤組織顯著減少，但在免疫活性異種移植腫瘤組織中沒(méi)有減少（圖 1F）?？傊?，這些結(jié)果表明腫瘤免疫環(huán)境參與 EGFR 突變腫瘤對(duì) EGFR-TKI 的耐藥性。

圖1-腫瘤免疫環(huán)境參與腫瘤對(duì) EGFR-TKIs 的耐藥性

• 腫瘤免疫環(huán)境由激活到抑制的動(dòng)態(tài)變化驅(qū)動(dòng) EGFR-TKIs 耐藥

為了了解腫瘤免疫環(huán)境如何參與對(duì) EGFR-TKI 的耐藥性，作者分析了治療過(guò)程中不同階段的腫瘤免疫環(huán)境特征（圖 2A）。作者測(cè)定了初始 EGFR-TKIs 治療時(shí)和耐藥發(fā)展期間 （P1-P3） 腫瘤免疫環(huán)境中腫瘤浸潤(rùn)白細(xì)胞 （TIL） 的密度，其中用鹽水處理的腫瘤細(xì)胞作為 CTRL 組，用厄洛替尼或奧希替尼治療的腫瘤細(xì)胞作為 TKI 組。流式細(xì)胞術(shù)分析的免疫分析顯示，在治療早期，攜帶 EGFR19del?的腫瘤的 EGFR-TKIs 治療誘導(dǎo)腫瘤浸潤(rùn)白細(xì)胞比例增加（圖2B）。然而，當(dāng)荷瘤小鼠對(duì) EGFR-TKI 產(chǎn)生耐藥性時(shí)，與 CTRL 組相比，腫瘤浸潤(rùn)白細(xì)胞的比例顯著降低（圖2B）。這表明荷瘤小鼠對(duì) EGFR-TKIs 的反應(yīng)性改變伴隨著腫瘤免疫環(huán)境的動(dòng)態(tài)變化。

為了準(zhǔn)確反映腫瘤免疫環(huán)境的真實(shí)狀態(tài)，作者檢查了藥物治療期間荷瘤小鼠腫瘤免疫環(huán)境中的 T 細(xì)胞浸潤(rùn)和功能。作者觀察到，兩種模型的 P1 荷瘤小鼠中 CD8+?T 細(xì)胞比例均顯著增加，但隨著 TKI 治療的繼續(xù)，這種增加消失。TKI 耐藥 P3 荷瘤小鼠中 CD8+?T 細(xì)胞的比例顯著降低（圖2C）。因此，作者假設(shè) T 淋巴細(xì)胞，尤其是 CD8+?T 細(xì)胞，從最初的激活開(kāi)始逐漸獲得功能失調(diào)的表型。為了檢驗(yàn)這一假設(shè)，作者檢查了效應(yīng)細(xì)胞因子在 T 細(xì)胞 （IFN-γ、IL-2、顆粒酶 B 和 TNF-α）中的表達(dá)。EGFR-TKIs 的初始治療刺激效應(yīng)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，但在耐藥發(fā)展的后期，效應(yīng)細(xì)胞因子的水平似乎降低，并且與 CTRL 相比，IFN-γ 和顆粒酶 B 的產(chǎn)生顯著減少（圖2D， E）。這些結(jié)果表明 EGFR-TKIs 顯著影響腫瘤免疫環(huán)境。初始治療會(huì)引發(fā)有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)，從而顯著減少腫瘤生長(zhǎng)。隨著時(shí)間的推移，EGFR-TKI 無(wú)法顯著控制腫瘤生長(zhǎng)，并伴有 T 細(xì)胞浸潤(rùn)和細(xì)胞因子產(chǎn)生的顯著減少。綜上所述，這些結(jié)果表明，隨著 EGFR-TKIs 治療時(shí)間的延長(zhǎng)，腫瘤細(xì)胞由藥物敏感變?yōu)槟退?，免疫反?yīng)首先增強(qiáng)后抑制。

圖2-腫瘤免疫環(huán)境由激活到抑制的動(dòng)態(tài)變化驅(qū)動(dòng) EGFR-TKIs 耐藥

• 對(duì) EGFR-TKI 的獲得性耐藥伴隨著 PD-L2 表達(dá)的上調(diào)

為了探索腫瘤免疫環(huán)境變化的原因，作者同時(shí)檢測(cè)了不同傳代階段腫瘤組織中刺激性和抑制性免疫調(diào)節(jié)分子的表達(dá)。在 EGFR-TKI 的初始治療中，一些抑制性免疫檢查點(diǎn)的相對(duì)表達(dá)降低（圖隨著耐藥性的出現(xiàn)，抑制性免疫檢查點(diǎn)基因 PD-L1 和 PD-L2 的相對(duì)表達(dá)水平逐漸升高，尤其是 PD-L2 （圖3A）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證 PD-L2 在 EGFR-TKI 耐藥腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的增加，作者通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)鑒定了 PD-L2 在 P3 腫瘤細(xì)胞厄洛替尼或奧希替尼處理的腫瘤細(xì)胞（耐藥，TKI 組）表面的表達(dá)，以生理鹽水處理的細(xì)胞為對(duì)照（敏感，CTRL 組）。作者的結(jié)果表明，與對(duì)照組織相比，腫瘤細(xì)胞表面 PD-L2 的表達(dá)在耐藥腫瘤組織中表現(xiàn)出顯著增加（圖3B）。接下來(lái)，為了進(jìn)一步驗(yàn)證，作者分析了先前構(gòu)建的 EGFR 突變的 TKI 耐藥 NSCLC 細(xì)胞系 HCC4006R、HCC827R、PC9R 及其配對(duì)親本細(xì)胞中免疫檢查點(diǎn)標(biāo)志物的表達(dá)水平。在三種耐藥細(xì)胞系中，PD-L2 的 mRNA 和蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，而 PD-L1 的表達(dá)表現(xiàn)出不一致的變化（圖3C、D）。

圖3-EGFR-TKI 的獲得性耐藥伴隨著 PD-L2 表達(dá)的上調(diào)

為了探索這種現(xiàn)象的臨床價(jià)值，作者分析了臨床數(shù)據(jù)庫(kù)。使用 GEO 數(shù)據(jù)集，作者分析了 8 例 EGFR TKIs 治療前后切除的臨床患者肺癌組織中 PDCD1LG2?（編碼 PD-L2） 和其他免疫檢查點(diǎn)基因的變化。與作者的結(jié)果類似，作者觀察到 EGFR TKI 治療后患者組織中 PDCD1LG2?表達(dá)增加，但其他免疫檢查點(diǎn)相關(guān)基因沒(méi)有增加（圖3E）。此外，作者認(rèn)為其他因素，例如 MET 擴(kuò)增，可能涉及 EGFR-TKI 耐藥。作者利用 TCGA 數(shù)據(jù)集研究了 EGFR-TKIs 耐藥驅(qū)動(dòng)基因的表達(dá)與人 CD274?（編碼 PD-L1） 或 PDCD1LG2?表達(dá)之間的關(guān)系。計(jì)算各驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)水平與 CD274?或 PDCD1LG2?表達(dá)水平之間的相關(guān)系數(shù)。結(jié)果表明，PD-L2 表達(dá)而不是 PD-L1 表達(dá)與 EGFR-TKIs 耐藥驅(qū)動(dòng)基因的表達(dá)呈顯著正相關(guān)（圖 3F）。與體外實(shí)驗(yàn)中的 PD-L1 過(guò)表達(dá)細(xì)胞相比，PD-L2 過(guò)表達(dá)的 PC9 細(xì)胞對(duì)上述耐藥驅(qū)動(dòng)基因相關(guān)的抑制劑的抵抗力增強(qiáng)（圖3F）。這些結(jié)果與一些研究表明 EGFR-TKIs 耐藥機(jī)制與 PD-L1 表達(dá)有關(guān)的研究形成鮮明對(duì)比?？偠灾?，作者的結(jié)果提供了初步證據(jù)，表明 PD-L2 而不是 PD-L1 可能是介導(dǎo) EGFR-TKIs 治療過(guò)程中腫瘤環(huán)境免疫抑制作用和驅(qū)動(dòng)耐藥的關(guān)鍵分子。

• PD-L2 通過(guò)影響腫瘤免疫環(huán)境在介導(dǎo) EGFR-TKIs 耐藥中發(fā)揮關(guān)鍵作用

為了研究 PD-L2 表達(dá)在免疫系統(tǒng)中的獨(dú)特作用和對(duì) EGFR-TKI 的反應(yīng)，作者在 CT26-EGFR19del?細(xì)胞系中過(guò)表達(dá) PD-L1 和 PD-L2，并建立了 BALB/c 同基因小鼠模型（圖 4A）。使用攜帶空載體的 CT26-EGFR19del細(xì)胞系作為對(duì)照。作者通過(guò)測(cè)量腫瘤體積評(píng)估空載體組、PD-L1 過(guò)表達(dá)組和 PD-L2 過(guò)表達(dá)組小鼠腫瘤對(duì)厄洛替尼治療的敏感性。結(jié)果顯示，與空載體組相比，PD-L2 過(guò)表達(dá)組小鼠對(duì)厄洛替尼的腫瘤耐藥性顯著增加，但 PD-L1 過(guò)表達(dá)組對(duì)厄洛替尼的腫瘤耐藥性沒(méi)有增加（圖4B，C）。這些結(jié)果表明，PD-L2 的過(guò)表達(dá)會(huì)增加腫瘤細(xì)胞對(duì) EGFR-TKIs 的耐藥性。為了進(jìn)一步證實(shí)作者的發(fā)現(xiàn)，作者檢查了 PD-L1 或 PD-L2 過(guò)表達(dá)對(duì) EGFR-TKIs 治療荷瘤小鼠腫瘤免疫環(huán)境中 T 細(xì)胞浸潤(rùn)和細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響。結(jié)果顯示，CD4+?T 細(xì)胞占總 CD3+?T 細(xì)胞的比例在 3 組間差異不顯著。值得注意的是，與空載體組相比，PD-L2 過(guò)表達(dá)組的 CD8+?T 細(xì)胞占總 CD3+?T 細(xì)胞的百分比以及細(xì)胞因子 IFN-γ 和顆粒酶 B 的表達(dá)顯著降低（圖 4D）。然而，PD-L1 過(guò)表達(dá)組中的細(xì)胞因子 IFN-γ 和顆粒酶 B 沒(méi)有顯著變化（圖 4D）。免疫組化染色顯示，與空載體和 PD-L1 過(guò)表達(dá)組相比，PD-L2 過(guò)表達(dá)組腫瘤細(xì)胞增殖顯著增加（圖4E）。以上結(jié)果進(jìn)一步表明，PD-L2 在厄洛替尼治療期間在抑制免疫反應(yīng)、抑制細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞浸潤(rùn)和減少小鼠效應(yīng)細(xì)胞因子產(chǎn)生方面起主導(dǎo)作用。因此，作者得出結(jié)論，在 EGFR-TKIs 治療過(guò)程中，PD-L2 水平升高通過(guò)介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞對(duì) EGFR-TKIs 的治療反應(yīng)。

圖4-PD-L2 通過(guò)影響腫瘤免疫環(huán)境在介導(dǎo) EGFR-TKIs 耐藥中發(fā)揮關(guān)鍵作用

鑒于 PD-L2 在體內(nèi)調(diào)節(jié) T 細(xì)胞活性中的關(guān)鍵作用，作者通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，PD-L2 的穩(wěn)定沉默增加了 EGFR-TKI 的敏感性（圖4F，G）。為了進(jìn)一步研究 PD-L2 如何影響對(duì) EGFR-TKI 的耐藥動(dòng)力學(xué)，作者在 EGFR-TKI 耐藥同基因小鼠模型的開(kāi)發(fā)中穩(wěn)定地沉默了 CT26-EGFRmut 細(xì)胞系中的 PD-L2（圖4H）。結(jié)果顯示，厄洛替尼在第一代顯著抑制 CT26-EGFR19del?衍生腫瘤的生長(zhǎng)。重要的是，PD-L2 沉默導(dǎo)致對(duì) EGFR-TKI 治療的耐藥性延遲發(fā)生。即使在第三代 （P3） 時(shí)對(duì)照組 （CT26-EGFR19del?shNC 衍生腫瘤） 出現(xiàn)耐藥性 （腫瘤抑制率 = 13.5%），PD-L2 沉默的腫瘤對(duì) EGFR-TKIs 保持高敏感性 （腫瘤抑制率 = 52.7%） （圖4I，J）。綜上所述，作者的基因操作實(shí)驗(yàn)表明，PD-L2 通過(guò)影響腫瘤免疫微環(huán)境在介導(dǎo) EGFR-TKIs 耐藥中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

• 阻斷 PD-L2/PD-1 聯(lián)合 EGFR-TKI 可抑制 EGFR-TKI 耐藥細(xì)胞或腫瘤的生長(zhǎng)

接下來(lái)，作者想進(jìn)一步探討阻斷 EGFR-TKI 耐藥細(xì)胞中的 PD-L2/PD-1 是否可以通過(guò)增強(qiáng)免疫反應(yīng)來(lái)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì) EGFR-TKIs 的敏感性。作者建立了攜帶對(duì)奧希替尼耐藥的 LLC-EGFR19del?衍生腫瘤的同基因小鼠模型。小鼠接受生理鹽水 （CTRL）、奧希替尼 （Os）、抗 PD-1 （αPD-1） 和奧希替尼 + 抗 PD-1 （Combi） 治療（圖5A）。作者的結(jié)果表明，與 CTRL 組相比，單獨(dú)使用奧希替尼組小鼠的腫瘤體積和生存時(shí)間沒(méi)有顯著差異。PD-1 抑制劑對(duì) EGFR-TKI 耐藥腫瘤表現(xiàn)出部分抑制，并導(dǎo)致小鼠存活時(shí)間適度延長(zhǎng)，盡管沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然而，奧希替尼和抗 PD-1 的組合顯著抑制了腫瘤生長(zhǎng)并延長(zhǎng)了攜帶耐藥腫瘤的小鼠的生存期（圖5B，C）。以上結(jié)果表明，抑制 PD-1 與 EGFR-TKI 聯(lián)合有效抑制了 EGFR-TKI 耐藥腫瘤的生長(zhǎng)。

此外，作者進(jìn)一步確定了在耐藥細(xì)胞中穩(wěn)定敲低 PD-L2 是否可以增強(qiáng)這些細(xì)胞對(duì) EGFR-TKIs 的敏感性，為了區(qū)分 PD-L1 和 PD-L2 的作用，作者生成了 PD-L1 和 PD-L2 穩(wěn)定沉默的 PC9R 細(xì)胞系。與 PD-L1 沉默細(xì)胞相比，PD-L2 沉默的腫瘤細(xì)胞對(duì) EGFR-TKI 更敏感，它們更有效地增加了 T 細(xì)胞的增殖和 CD8+?T 細(xì)胞的比例（圖5D，E）。此外，作者使用抗體阻斷 PD-L1、PD-L2 和 PD-1 的功能獲得了一致的結(jié)論。抗 PD-L2 和 PD-1 的抗體使腫瘤細(xì)胞對(duì) EGFR-TKI 更敏感，并增加了 T 細(xì)胞的增殖，CD8+ T 細(xì)胞的比例更高（圖5F， G）。上述體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)表明，PD-L2 的高表達(dá)通過(guò)影響免疫反應(yīng)來(lái)影響 EGFR 突變細(xì)胞對(duì) EGFR-TKIs 的敏感性。因此，PD-1/PD-L2 信號(hào)傳導(dǎo)，而不是 PD-1/PD-L1 信號(hào)傳導(dǎo)，可能在介導(dǎo)對(duì) EGFR-TKI 的耐藥中發(fā)揮重要作用。

圖5-阻斷 PD-L2/PD-1 聯(lián)合 EGFR-TKI 可抑制 EGFR-TKI 耐藥細(xì)胞或腫瘤的生長(zhǎng)

• PD-L2 過(guò)表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞凋亡并促進(jìn)對(duì) EGFR-TKI 的耐藥

接下來(lái)，作者進(jìn)一步探討了 PD-L2 表達(dá)升高影響免疫反應(yīng)以降低腫瘤對(duì) EGFR-TKIs 敏感性的機(jī)制。作者獲得了來(lái)自空載體或 PD-L2 過(guò)表達(dá)的同基因小鼠中 CT26-EGFR19del?細(xì)胞的腫瘤組織的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組譜。作者對(duì)來(lái)自空載體樣本和 PD-L2 過(guò)表達(dá)樣本的整合單細(xì)胞數(shù)據(jù)集進(jìn)行了聚類分析，并確定了六個(gè)主要的不同細(xì)胞群（圖6A、B）。作者發(fā)現(xiàn) PD-L2 過(guò)表達(dá)組中癌細(xì)胞的數(shù)量顯著增加，T 細(xì)胞的比例顯著降低（圖6C）。為了探索 EGFR-TKIs 耐藥的機(jī)制，作者分析了癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組特征。與空載體組相比，對(duì) PD-L2 過(guò)表達(dá)組的差異表達(dá)基因進(jìn)行 KEGG 富集分析。作者觀察到細(xì)胞凋亡通路顯著富集（圖 6D）。GSEA 分析顯示，PD-L2 過(guò)表達(dá)組癌細(xì)胞中與細(xì)胞凋亡途徑相關(guān)的基因顯著下調(diào)（圖6E）。這些結(jié)果表明，EGFR 突變腫瘤細(xì)胞中 PD-L2 表達(dá)的增加可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡減少。作者的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)一步驗(yàn)證了這些結(jié)論。TUNEL 染色顯示，與對(duì)照組相比，TKI 處理后 CT26-EGFR19del?PD-L2 過(guò)表達(dá)組腫瘤細(xì)胞凋亡受到顯著抑制（圖6F）?；谶@些結(jié)果，作者假設(shè) EGFR 突變的腫瘤細(xì)胞中 PD-L2 表達(dá)增加會(huì)抑制癌細(xì)胞的凋亡，從而導(dǎo)致癌細(xì)胞的持續(xù)生長(zhǎng)，耐藥性增加。

圖6-PD-L2 過(guò)表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞凋亡并促進(jìn)對(duì) EGFR-TKI 的耐藥

• PD-L2 過(guò)表達(dá)抑制 CD8+T 細(xì)胞通過(guò)穿孔素-顆粒酶 B 通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的功能

為了進(jìn)一步了解 PD-L2 對(duì)腫瘤免疫環(huán)境的抑制作用，作者回到了作者的單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)。根據(jù) CD45 的表達(dá)，將空載體和 PD-L2 過(guò)表達(dá)組的腫瘤環(huán)境中細(xì)胞分為 CD45-?腫瘤細(xì)胞和 CD45+?免疫細(xì)胞（圖7A）。然后根據(jù)已知遺傳標(biāo)記的表達(dá)和細(xì)胞亞群的特異性注釋對(duì) CD45+?免疫細(xì)胞進(jìn)行分組（圖 7B）。在 PD-L2 過(guò)表達(dá)組中，作者觀察到 CD8+?T 細(xì)胞群的大小顯著減?。▓D7B，C）。因此，作者通過(guò) KEGG 富集分析了空載體組和 PD-L2 過(guò)表達(dá)組 CD8+?T 細(xì)胞中的差異表達(dá)基因（圖 7D）。作者發(fā)現(xiàn)與增殖和細(xì)胞毒功能相關(guān)的通路顯著富集（圖7E）。為了進(jìn)一步證實(shí) PD-L2 過(guò)表達(dá)顯著影響 CD8+?T 細(xì)胞活性，作者從總 T 細(xì)胞中分離 CD8+?T 細(xì)胞，并將它們與 PD-L1 或 PD-L2 基因操縱的小鼠腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)。結(jié)果顯示，CD8+?T 細(xì)胞的增殖在 PD-L2 過(guò)表達(dá)細(xì)胞中受到顯著抑制，而在 PD-L1 過(guò)表達(dá)細(xì)胞中則不受抑制（圖7F）。然后，作者從總 T 細(xì)胞中分離 CD4+?T 細(xì)胞，并將它們與 PD-L1 或 PD-L2 基因操縱的小鼠腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)。值得注意的是，PD-L2 過(guò)表達(dá)對(duì) CD4+?T 細(xì)胞的增殖沒(méi)有影響，而 PD-L1 過(guò)表達(dá)顯著抑制了 CD4+?T 細(xì)胞的增殖（圖7G）。這表明 PD-L2 和 PD-L1 介導(dǎo) T 細(xì)胞抑制的分子機(jī)制存在差異。

許多研究表明，CD8+?T 細(xì)胞可通過(guò) Fas-FasL 通路或穿孔素-顆粒酶 B 通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。因此，作者接下來(lái)使用純化的 CD8⁺?T 細(xì)胞與 PD-L1 或 PD-L2 基因操縱的小鼠腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，并研究 EGFR-TKIs 處理后腫瘤細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果顯示，與 PD-L1 過(guò)表達(dá)細(xì)胞相比，PD-L2 過(guò)表達(dá)減少了 EGFR-TKI 處理后 CD8+?T 細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡（圖7H）。接下來(lái)，作者試圖檢查腫瘤細(xì)胞 PD-L1 或 PD-L2 過(guò)表達(dá)對(duì) CD8+?T 細(xì)胞分泌細(xì)胞毒性細(xì)胞因子的影響。正如預(yù)期的那樣，與 PD-L1 過(guò)表達(dá)相比，PD-L2 過(guò)表達(dá)顯著抑制了 CD8+?T 細(xì)胞顆粒酶 B 和穿孔素伴隨 EGFR-TKI 治療的分泌（圖7I）。綜上所述，EGFR 突變腫瘤細(xì)胞中 PD-L2 的過(guò)表達(dá)顯著抑制了 CD8+?T 細(xì)胞的增殖和細(xì)胞毒功能，主要是通過(guò)抑制穿孔素和顆粒酶 B 的分泌，從而減少腫瘤細(xì)胞的凋亡。

圖7-PD-L2 過(guò)表達(dá)抑制 CD8+?T 細(xì)胞通過(guò)穿孔素-顆粒酶 B 通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的功能

• ZU 作為天然存在的 PD-L2 小分子抑制劑的篩選和活性評(píng)價(jià)

由于目前市場(chǎng)上沒(méi)有靶向 PD-L2 的藥物，作者使用 HTRF 技術(shù)篩選了 1300 多種天然小分子化合物的庫(kù)，以鑒定 PD-L2 的特異性抑制劑。作者發(fā)現(xiàn)了一種小分子化合物十一烯酸鋅 （ZU），它選擇性地抑制 PD-L2/PD-1 結(jié)合，EC50?8.4 μM，而 PD-L1/PD-1 為 >80 μM（圖8A， B）。ZU 是由蓖麻油通過(guò)一系列化學(xué)反應(yīng)和凈化過(guò)程生產(chǎn)的。CETSA 實(shí)驗(yàn)表明，與 PD-L1/PD-1 相比，ZU 有效抑制了 PD-L2 與 PD-1 的結(jié)合（圖8C）。這些結(jié)果表明 ZU 具有阻斷 PD-L2/PD-1 相互作用的特異性能力。此外，作者利用空載體或 PD-L2 過(guò)表達(dá)的小鼠 CT26 細(xì)胞來(lái)驗(yàn)證 ZU 的體外抗腫瘤作用。在 40 μM 濃度下，ZU 不會(huì)顯著降低 CT26 空載體和 PD-L2 過(guò)表達(dá)細(xì)胞的活力（圖8D），這表明 ZU 沒(méi)有直接的細(xì)胞毒性作用。然而，當(dāng)腫瘤細(xì)胞與活化的 T 細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，與 CT26 空載體細(xì)胞相比，ZU （40 μM） 顯著抑制了 CT26 PD-L2 過(guò)表達(dá)細(xì)胞的活力（圖8D）。這表明 ZU 通過(guò)靶向 PD-L2/PD-1 的免疫調(diào)節(jié)發(fā)揮抗腫瘤作用。使用具有空載體和 PD-L2 過(guò)表達(dá)的 PC9 細(xì)胞獲得了類似的結(jié)果（圖8D）。此外，作者研究了 ZU 和 EGFR-TKI 對(duì)親本和 TKI 耐藥 NSCLC 細(xì)胞的聯(lián)合抑制作用。對(duì)于耐藥細(xì)胞，結(jié)果表明，厄洛替尼聯(lián)合 ZU 對(duì) 827 R 或 PC9R 細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制具有協(xié)同作用，與單獨(dú)使用厄洛替尼相比，耐藥細(xì)胞的存活率顯著降低（圖8E）。重要的是，在沒(méi)有活化的 T 細(xì)胞的情況下，厄洛替尼聯(lián)合 ZU 的細(xì)胞殺傷效果沒(méi)有顯著差異（圖8E）。上述結(jié)果進(jìn)一步表明，靶向 PD-L2 的 ZU 與 EGFR-TKI 的組合對(duì)耐藥腫瘤表現(xiàn)出協(xié)同抑制作用。

接下來(lái)，作者評(píng)估了 ZU 是否通過(guò)靶向 PD-L2 可以改善腫瘤免疫反應(yīng)。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，與單獨(dú)使用厄洛替尼或 ZU 相比，厄洛替尼聯(lián)合 ZU 顯著增加了 CD8+?T 細(xì)胞的比例和顆粒酶 B 的表達(dá)（圖8F，G）。作者進(jìn)一步檢測(cè)到與活化 T 細(xì)胞共培養(yǎng)的 827 個(gè) R 或 PC9R 細(xì)胞的凋亡水平。作者發(fā)現(xiàn)厄洛替尼聯(lián)合 ZU 顯著促進(jìn)免疫細(xì)胞介導(dǎo)的 EGFR-TKI 耐藥細(xì)胞凋亡（圖8H）。相比之下，當(dāng)用厄洛替尼加 ZU 處理耐藥細(xì)胞時(shí)，在沒(méi)有活化的 T 細(xì)胞或細(xì)胞凋亡抑制劑（泛半胱天冬酶抑制劑 Z-VAD-FMK 和特異性顆粒酶 B 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡抑制劑 Z-IETD-FMK）的情況下未觀察到細(xì)胞凋亡（圖8H）。這進(jìn)一步證明了耐藥細(xì)胞的凋亡是由免疫細(xì)胞介導(dǎo)的。此外，顆粒酶 B （Z-IETD-FMK） 的抑制有效地消除了細(xì)胞凋亡，突出了顆粒酶 B 在 ZU 和 EGFR-TKI 誘導(dǎo)的耐藥癌細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵作用（圖8H）?？傊?，這些結(jié)果表明天然小分子抑制劑 ZU 可以有效和特異性地抑制 PD-L2。當(dāng)與 EGFR-TKIs 聯(lián)合使用時(shí)，ZU 可以通過(guò)在體外激活免疫細(xì)胞介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來(lái)顯著逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性。

圖8-ZU 作為天然存在的 PD-L2 小分子抑制劑的篩選和活性評(píng)價(jià)

• ZU 改善抑制性腫瘤免疫環(huán)境，在體內(nèi)逆轉(zhuǎn) EGFR-TKIs 耐藥

為了進(jìn)一步證實(shí) ZU 和 EGFR-TKIs 的組合協(xié)同改善腫瘤免疫環(huán)境并逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性，作者評(píng)估了 ZU + 厄洛替尼在攜帶 PD-L2 過(guò)表達(dá)的 CT26-EGFR19del?來(lái)源的腫瘤的 BALB/c 同基因小鼠中的療效（圖9A）。腫瘤體積曲線顯示，與鹽水處理組相比，單獨(dú)使用厄洛替尼在治療 15 天后表現(xiàn)出邊緣性腫瘤生長(zhǎng)抑制（圖9B），這表明 PD-L2 的過(guò)表達(dá)增加了腫瘤細(xì)胞對(duì) TKI 的耐藥性。ZU 單次治療并未阻斷腫瘤生長(zhǎng)（圖9B），這表明單獨(dú)靶向 PD-L2 不能逆轉(zhuǎn)厄洛替尼耐藥性。正如預(yù)期的那樣，陽(yáng)性對(duì)照組 （Er + ADVshPD-L2） 在所有測(cè)試的模型中反應(yīng)最好（圖9B）。此外，ZU + 厄洛替尼組與陽(yáng)性對(duì)照組相比沒(méi)有顯著差異，這表明 ZU 可以有效抑制 PD-L2，并且當(dāng)與厄洛替尼聯(lián)合使用時(shí)，可以顯著逆轉(zhuǎn)厄洛替尼耐藥性（圖9B）。此外，流式細(xì)胞術(shù)和免疫組化結(jié)果顯示，聯(lián)合治療增加了腫瘤組織中浸潤(rùn)白細(xì)胞（CD45+）的比例、T 細(xì)胞的活化 （CD3+CD69+）以及CD8+?T 細(xì)胞（CD8⁺GzmB+）的比例和功能（圖9C）。免疫組化顯示，聯(lián)合治療顯著抑制了增殖（圖9D）。為了全面評(píng)價(jià) EGFR-TKIs 聯(lián)合 ZU 的療效，作者建立了攜帶對(duì)奧希替尼耐藥的 LLC-EGFR19del?衍生腫瘤和對(duì)厄洛替尼耐藥的 CT26 EGFR19del?衍生腫瘤的同基因小鼠模型。小鼠接受生理鹽水（CTRL）、單獨(dú) EGFR-TKIs、 單獨(dú) ZU和EGFR-TKIs + ZU處理。作者的結(jié)果表明，與生理鹽水組相比，單獨(dú)使用 EGFR-TKIs 組或單獨(dú)使用 ZU 組小鼠的生存時(shí)間沒(méi)有顯著差異（圖9E， F）。然而，ZU 和 EGFR-TKIs（奧希替尼或厄洛替尼）的組合顯著延長(zhǎng)了攜帶耐藥腫瘤的小鼠的生存期（圖9E，F(xiàn)）。這些結(jié)果表明，ZU 聯(lián)合 EGFR-TKIs 可以通過(guò)改善同基因小鼠模型中的腫瘤免疫環(huán)境來(lái)有效逆轉(zhuǎn)對(duì) EGFR-TKIs 的耐藥性。綜上所述，ZU 通過(guò)抑制 PD-L2 增強(qiáng) CD8+?T 細(xì)胞的功能，其與 EGFR-TKIs 的聯(lián)合作用可有效抑制耐藥腫瘤的增殖。

圖9-ZU 改善抑制性腫瘤免疫環(huán)境，在體內(nèi)逆轉(zhuǎn) EGFR-TKIs 耐藥

在該研究中，由于難以獲得對(duì)?EGFR-TKIs?耐藥的臨床腫瘤樣本，作者使用轉(zhuǎn)染人?EGFR?突變體 （外顯子19?缺失） 的小鼠細(xì)胞系建立?EGFR-TKI?耐藥同基因小鼠模型約五個(gè)月，這是使用基因工程小鼠難以實(shí)現(xiàn)的。值得注意的是，該研究的?TKI?耐藥模型的關(guān)鍵點(diǎn)是將初始抑制率與不同傳代模型中的抑制率進(jìn)行了比較，例如?Os?治療的?LLC?從?44%?到?-12.3%，Er?治療的?CT26?從?55%?到?11.2%。因此，該研究認(rèn)為該模型可以反映臨床?TKI?給藥中的耐藥過(guò)程。這種方法使作者能夠研究?EGFR-TKIs?治療過(guò)程與腫瘤免疫環(huán)境之間的關(guān)系。作者的結(jié)果表明，EGFR-TKIs?對(duì)腫瘤免疫環(huán)境具有顯著而顯著的影響。當(dāng)?EGFR-TKIs?治療有效時(shí)，抗腫瘤免疫反應(yīng)增強(qiáng)。然而，當(dāng)發(fā)生耐藥性時(shí)，作者觀察到腫瘤浸潤(rùn)白細(xì)胞的比例顯著降低，CD8+?T?細(xì)胞的比例和功能降低。不斷變化的腫瘤免疫環(huán)境可能是?PD-1?阻斷治療后立即再次用?EGFR-TKIs?攻擊對(duì)?EGFR-TKI?耐藥的?NSCLC?患者有效的原因 。此外，作者得出結(jié)論，抑制性腫瘤免疫環(huán)境是參與對(duì)?EGFR-TKIs?耐藥的機(jī)制之一。因此，作者從非遺傳角度揭示了?EGFR-TKIs 耐藥的新機(jī)制。

2024年8月21日，北京大學(xué)崔一民、安徽醫(yī)科大學(xué)王華教授共同通訊在Journal of Hepatology期刊在線發(fā)表題為“Thyroid hormone receptor-beta agonist HSK31679 alleviates MASLD by modulating gut microbial sphingolipids”的研究論文。研究團(tuán)隊(duì)運(yùn)用宏基因組、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和代謝組組學(xué)研究了甲狀腺激素受體-β激動(dòng)劑HSK31679在改善代謝相關(guān)脂肪性肝炎（MASH）方面的作用，并探究了腸道菌群在其中扮演的角色。研究發(fā)現(xiàn)，HSK31679能夠有效改善SPF小鼠的MASH，但無(wú)菌小鼠則沒(méi)有這種效果，說(shuō)明腸道菌群在HSK31679的治療中起到了關(guān)鍵作用。研究還發(fā)現(xiàn)，HSK31679能夠增加腸道擬桿菌thetaiotaomicron的相對(duì)豐度，并抑制其萄糖神經(jīng)酰胺合成酶（GCS）活性，從而減少腸道微生物鞘脂的單糖基化，進(jìn)而改善肝臟脂肪積累。此外，HSK31679還能夠重塑髓系細(xì)胞動(dòng)態(tài)，使其向抗炎微環(huán)境轉(zhuǎn)變，從而進(jìn)一步減輕MASH。

文章標(biāo)題：Thyroid hormone receptor-beta agonist HSK31679 alleviates MASLD by modulating gut microbial sphingolipids

發(fā)表期刊：Journal of Hepatology

影響因子：26.8

合作單位：北京大學(xué)

研究對(duì)象：小鼠模型、臨床隊(duì)列

研究方法：微生物多樣性測(cè)序，宏基因組測(cè)序，代謝組檢測(cè)

百邁客生物為該研究提供了微生物多樣性測(cè)序，宏基因組測(cè)序，代謝組檢測(cè)服務(wù)。

研究背景

甲狀腺激素受體-β (THR-β) 激動(dòng)劑，如 MGL-3196 和 HSK31679，因其對(duì) THR-β 的選擇性高而被認(rèn)為是治療 MASH 的新興藥物。MGL-3196在臨床試驗(yàn)中表現(xiàn)出良好的療效，但其個(gè)體臨床療效差異較大，且存在腸道通透性差的問(wèn)題。HSK31679 是 MGL-3196 的衍生物，其療效和安全性正在進(jìn)一步研究中。腸道微生物組與宿主的代謝健康密切相關(guān)，其組成和功能的改變與 MASH 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。腸道微生物可以產(chǎn)生多種酶，參與宿主血漿脂質(zhì)代謝，并可能影響 THR-β 激動(dòng)劑的活性。該研究旨在探索腸道微生物在 THR-β 激動(dòng)劑治療 MASH 中的作用，評(píng)估 HSK31679 的療效和機(jī)制以及為 MASH 的治療提供新的思路和靶點(diǎn)。

材料方法

1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

對(duì)無(wú)菌小鼠和 SPF 小鼠進(jìn)行高脂飲食誘導(dǎo)的 MASH 模型構(gòu)建，分別給予 MGL-3196 和 HSK31679 治療，觀察肝脂肪變性程度和肝臟指標(biāo)變化。

對(duì) SPF 小鼠進(jìn)行?B. thetaiotaomicron 菌株定殖，觀察 HSK31679 對(duì) MASH 模型的影響。

2.微生物組分析：

對(duì)參與者的糞便進(jìn)行宏基因組測(cè)序，分析腸道菌群組成變化。

對(duì)參與者的糞便和血清進(jìn)行脂質(zhì)組學(xué)分析，檢測(cè)腸道微生物產(chǎn)生的鞘脂類物質(zhì)變化。

3.單細(xì)胞 RNA 測(cè)序：

對(duì)18例PBMC樣本進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分析 HSK31679 對(duì)免疫細(xì)胞的影響。

研究結(jié)果

1.HSK31679 在 SPF 小鼠中優(yōu)于 MGL-3196 治療高脂飲食誘導(dǎo)的 MASH

為了研究THR-β激動(dòng)劑治療 MASH對(duì)腸道微生物群的影響，研究者在沒(méi)有腸道微生物定群的情況下飼養(yǎng)的C57 BL/6 GF小鼠喂食高脂肪、果糖和膽固醇飲食（MASH飲食）和SPF對(duì)照組16周。然后每日給予MGL-3196或HSK 31679 3毫克/kg劑量，口服，持續(xù)8周（圖1A）。如圖1B所示，MGL-3196灌胃對(duì)SPF和GF小鼠的體重均沒(méi)有明顯影響，而HSK 31679導(dǎo)致SPF小鼠的體重增加具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但GF小鼠沒(méi)有。服用MASH飲食然后接受MGL- 243 3196/HSK 31679處理的SPF小鼠表現(xiàn)出肝臟重量明顯下降（p < 0.01;圖1C），HSK31679 組 SPF 小鼠的體重增加、肝臟重量、血清和肝臟甘油三酯和膽固醇水平、血清 ALT、AST 和 GGT 水平以及肝臟脂質(zhì)變性程度均顯著低于 MGL-3196 組。HSK31679 組 SPF 小鼠的肝臟炎癥和纖維化相關(guān)基因表達(dá)水平也顯著低于 MGL-3196 組。無(wú)菌小鼠模型中，MGL-3196 和 HSK31679 組的 MASH 病理表現(xiàn)相似，表明 HSK31679 的療效依賴于腸道菌群。

圖1-HSK31679在改善MASH飲食誘導(dǎo)的SPF小鼠脂肪性肝炎方面優(yōu)于MGL-3196，但在改善GF小鼠方面則不然

2.HSK31679 治療增加了腸道 B. thetaiotaomicron?的相對(duì)豐度

在MASH飲食喂養(yǎng)16周和HSK31679治療8周后，觀察到SPF小鼠富含腸道擬桿菌thetaiotaomicron（B. thetaiotaomicron）（圖1I、J和S2D）。NMDS和PCA分析表明HSK31679重塑了β多樣性譜，而每組腸道微生物群的Shannon和Simpson多樣性指數(shù)略有差異（圖S2G和H）。在微生物功能方面，通過(guò)KEGG分析富集的7,458條功能途徑。其中22條途徑在HSK31679治療后有所不同，包括參與激活神經(jīng)鞘脂（SL）代謝的途徑，在HSK31679實(shí)驗(yàn)組中，B. thetaiotaomicron與上調(diào)的己糖神經(jīng)酰胺加工基因密切相關(guān)（圖1L）。

為了臨床驗(yàn)證微生物組組成的這種轉(zhuǎn)變，研究者收集了40名健康參與者的糞便樣本，這些參與者接受了每周3次的HSK31679多次遞增劑量治療，持續(xù)14天。對(duì)參與者的糞便進(jìn)行宏基因組測(cè)序分析，鑒定了代表183個(gè)科和119個(gè)屬的415種微生物物種。香農(nóng)和辛普森多樣性指數(shù)在兩組中幾乎沒(méi)有受到HSK31679治療的影響（圖S3A和B）。相比之下，PCA評(píng)分和NMDS均顯示了HSK31679處理14 d后腸道微生物群β多樣性譜的顯著變化。對(duì)51個(gè)不同的細(xì)菌屬進(jìn)行屬級(jí)微生物Spearman相關(guān)網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)HSK31679處理后有幾個(gè)屬與擬桿菌屬呈正相關(guān)（圖S3D）。

隨后通過(guò)LEfSe分析探索了HSK31679治療組14天與安慰劑組相比的腸道菌群差異，這進(jìn)一步揭示了桿菌屬的最大增量（圖2B，C）。值得注意的是，在第14天上升劑量為80mg、120mg、160mg HSK31679后，B. thetaiotaomicron的相對(duì)豐度表現(xiàn)出最明顯的逐漸上升（圖2C），并通過(guò)qPCR進(jìn)行了驗(yàn)證（圖2D），這表明B.thetaiotaomicron可能在HSK31679治療期間發(fā)揮關(guān)鍵中介作用。KEGG通路分析富集了20個(gè)信號(hào)通路的154個(gè)功能基因，其中神經(jīng)酰胺代謝被HSK31679處理激活（圖2E）。這些顯著的成分變化與以前對(duì)晚期脂肪性肝炎患者微生物種群負(fù)相關(guān)的研究一致。

圖2-HSK31679治療在遞增的多劑量隊(duì)列中豐富了腸道擬桿菌thetaiotaomicron的豐度

3.HSK31679 治療抑制了?B. thetaiotaomicron?產(chǎn)生的鞘脂類物質(zhì)的單糖基化過(guò)程

基于 B. thetaiotaomicron?的 SLs 可以轉(zhuǎn)移以調(diào)節(jié)肝臟脂肪變性這一認(rèn)識(shí)，隨后研究者試圖確定 HSK31679 314 治療是否已深入調(diào)節(jié) SLs 表型。對(duì)接受多次遞增劑量 HSK31679 316 和安慰劑治療的參與者的糞便代謝物進(jìn)行脂質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)?HSK31679 治療顯著降低了腸道 B. thetaiotaomicron?產(chǎn)生的鞘脂類物質(zhì)（如 Hex1Cer 和 Hex2Cer）的單糖基化程度。

HSK31679 治療組的腸道菌群與鞘脂類物質(zhì)之間存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，HSK31679 治療的綜合統(tǒng)計(jì)相關(guān)性分析證實(shí)，擬桿菌和普雷沃氏菌與 C16:0 和 C24:1 ?；湹募禾巧窠?jīng)酰胺呈負(fù)相關(guān)（圖 3D）。這表明口服 HSK31679 治療可抑制微生物對(duì)神經(jīng)酰胺的單糖基化。

圖3-HSK31679治療損害了微生物鞘脂單葡萄糖基化

4.thetaiotaomicron 的 GCS 活性對(duì) HSK31679 減輕 MASH 的作用至關(guān)重要

進(jìn)一步研究了HSK 31679介導(dǎo)的SLs 單糖基化的潛在機(jī)制。通過(guò)體外共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)無(wú)菌小鼠模型，發(fā)現(xiàn) HSK31679 治療抑制了 B. thetaiotaomicron?的 GCS 活性。在無(wú)菌小鼠模型中，B. thetaiotaomicron?GCS 活性缺失的小鼠對(duì) MGL-3196 和 HSK31679 的療效沒(méi)有顯著差異，而 GCS 活性存在的小鼠對(duì) HSK31679 的療效顯著優(yōu)于 MGL-3196。HSK31679 與 B. thetaiotaomicron GCS?的結(jié)合結(jié)構(gòu)分析表明，HSK31679 通過(guò)空間位阻效應(yīng)抑制了 GCS 的活性。

圖4-GCS是HSK31679減輕脂肪性肝炎不可或缺的酶

5.HSK31679治療的單細(xì)胞圖譜

為了深入了解腸道微生物GCS在所有免疫細(xì)胞群中治療HSK31679的獨(dú)特免疫作用，研究者使用基于液滴的單細(xì)胞平臺(tái)（10×Genomics Chromium）進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（scRNA-seq），分析了來(lái)自參與者隊(duì)列的18個(gè)外周血單核細(xì)胞（PBMC）樣本，包括3個(gè)用安慰劑（GH-PL）治療的糞便來(lái)源GCS高活性樣本、3個(gè)用160 mg HSK31679（GH-HS）治療的糞便來(lái)源GCS高活性樣本，和GCS低活性樣本（GL-HS）分別在第0天和第14天。從GH-PL、GH-HS、GL-HS數(shù)據(jù)集中獲得的128031個(gè)細(xì)胞中，共鑒定出57個(gè)細(xì)胞簇。通過(guò)SingleR v.1.0獲得的基于標(biāo)記的注釋，定義了四種主要的細(xì)胞類型：T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（NK）和B細(xì)胞、髓系細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞（EC）和間充質(zhì)細(xì)胞（圖5B）。通過(guò)計(jì)算觀察到的細(xì)胞數(shù)與預(yù)期細(xì)胞數(shù)的比值（Ro/e）來(lái)量化主要細(xì)胞團(tuán)相對(duì)不同的富集情況，發(fā)現(xiàn)髓系細(xì)胞團(tuán)構(gòu)成了GH-HS的主要改變的細(xì)胞成分，B細(xì)胞、EC團(tuán)主導(dǎo)了GL-HS樣本的細(xì)胞成分（圖5C、D和圖S8C）。鑒于如上所述，HSK31679治療通過(guò)B.thetaiotaomicron的GCS減輕了脂肪性肝炎，在隨后分析GH-HS和GL-HS之間的特定細(xì)胞區(qū)室時(shí)重點(diǎn)研究了髓系細(xì)胞。

圖5-160 mg HSK31679治療隊(duì)列的單細(xì)胞圖譜

6.HSK31679 治療重塑了髓系細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化，使其趨向于抗炎微環(huán)境

在所有髓系細(xì)胞亞群中，樹(shù)突狀細(xì)胞 (DC) 和巨噬細(xì)胞 (Mφ) 構(gòu)成了主要細(xì)胞類型（圖 5B）。通過(guò)無(wú)監(jiān)督聚類，首先關(guān)注 DCs 群體的內(nèi)在屬性和潛在功能，這些 DCs 群體被確定為減少的 CD8α+DCs（圖 6A、D）。值得注意的是，GH-HS 組中 Tregs 的 IL-12Rβ2 可以與 CD8α+DCs 衍生的 IL-35 相互作用（圖 6B、C）。如先前報(bào)道的那樣，可以增強(qiáng)炎癥過(guò)程的抑制功能。與GL-HS或GH-PL數(shù)據(jù)集相比，GH-HS的PBMCs中CD4+Foxp3+Tregs的數(shù)量增加（圖6D）。這些Tregs的抑制功能阻斷了IL-35的EBI3亞基的作用（圖6E），導(dǎo)致免疫原性顯著受損。這可能是由于STAT1/STAT3的異常激活和p38 MAPK/NF-κB信號(hào)通路的抑制（圖S8D和E）。此外，注意到DC簇的分布與γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（GGT）的表達(dá)相關(guān)（圖6B），GGT是MASH進(jìn)展的公認(rèn)血清生物標(biāo)志物。在GH-HS的所有DC中（圖6A），GGT+樣本中CD1C+DCs（cDC2）的比例顯著增加，而與GL-HS或GH-PL組相比，DEC205+DCs（cDC1）的比例降低。盡管之前的研究報(bào)告了cDCs在促進(jìn)或抑制脂肪性肝炎中的不確定作用，但結(jié)果表明，cDC1和cDC2細(xì)胞對(duì)HSK31679治療的反應(yīng)方式相反。

圖6-HSK31679介導(dǎo)的抗炎髓細(xì)胞動(dòng)力學(xué)減輕脂肪性肝炎進(jìn)展

對(duì)于巨噬細(xì)胞部分，通過(guò)無(wú)監(jiān)督聚類產(chǎn)生了6個(gè)具有不同基因特征的聚類。對(duì)兩個(gè)富含非經(jīng)典單核細(xì)胞簇的PBMCs進(jìn)行了表征：MINCLE+Mφ和S1PR2+Mφ。根據(jù)常規(guī)表型標(biāo)記物（TREM2+、MRC1+、CD163+、AGR1+）的高表達(dá)，其余簇均被鑒定為巨噬細(xì)胞（圖6A）。值得注意的是，巨噬細(xì)胞簇MINCLE+Mφ、S1PR2+Mφ和AGR1+Mφ顯示出相對(duì)不同的發(fā)展（圖6F、G）。在這些巨噬細(xì)胞簇中，AGR1+Mφ和MINCLE+Mφ是GH-HS和GL-HS組中改變的主要亞群，而S1PR2+Mφ在GH-HS組更具特征（圖5C）。然后研究了它們的不同功能狀態(tài)，并觀察到趨化因子（CCL3/15和CXCL10/12/14）在GH-HS中的表達(dá)降低，但在GL-HS樣本中沒(méi)有，這表明其是由這些Mφ簇募集T細(xì)胞的過(guò)程。GH-HS樣本的細(xì)胞相互作用分析也證實(shí)，抗炎巨噬細(xì)胞通過(guò)CCL3/15-CCR5、CXCL10/11-CXCR5和CXCL12/14-CXCR4信號(hào)傳導(dǎo)積極參與T細(xì)胞的募集（圖6C和S9B）。在GL-HS組中，MRC1+Mφ表達(dá)的CCL15/CXCL10水平升高，AGR1+Mφ高度表達(dá)CCL2/CXCL12（圖S9B）；而GH-HS組CCL22簇的優(yōu)勢(shì)Mφ從MINCLE+Mφ切換（圖6H和S9D），其AGR1+Mφ上調(diào)了RPS27、CDKN1C和KLRF1的表達(dá)水平（圖S10B），表明經(jīng)HSK31679處理的糞便來(lái)源GCS+參與者的巨噬細(xì)胞發(fā)生了重編程?？偨Y(jié)HSK31679治療的上述代謝指標(biāo)，GCS活性和糞便中B.thetaiotaomicron的相對(duì)豐度與肝臟ΔTG、ΔTC和ΔGGT水平等呈顯著負(fù)相關(guān)（圖6I）。這些結(jié)果表明，B.thetaiotaomitron介導(dǎo)的免疫抑制的GCS活性可能預(yù)測(cè)HSK31679治療個(gè)體的MASH緩解。

研究總結(jié)

該研究描繪了HSK31679通過(guò)抑制腸道微生物鞘脂的單糖基化來(lái)改善MASH的新圖譜。這項(xiàng)研究為腸道微生物和循環(huán)免疫因素提供了新的見(jiàn)解，這些因素可以作為MASH患者HSK31679治療的預(yù)后標(biāo)志物，以及基于腸道微生物群的MASLD治療的新靶點(diǎn)或策略。對(duì)于甲狀腺模擬物的進(jìn)一步4期上市后研究，應(yīng)系統(tǒng)地調(diào)查大規(guī)模隊(duì)列，研究抗菌組合對(duì)MASH個(gè)體長(zhǎng)期結(jié)果的影響。

文章亮點(diǎn)

該研究證明了腸道微生物在 THR-β 激動(dòng)劑治療 MASH 中的重要作用。發(fā)現(xiàn) HSK31679 通過(guò)抑制腸道 B. thetaiotaomicron?產(chǎn)生的鞘脂類物質(zhì)的單糖基化過(guò)程來(lái)減輕 MASH。揭示了腸道 GCS 活性可以作為 HSK31679 治療 MASH 的預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物。發(fā)現(xiàn) HSK31679 治療重塑了髓系細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化，使其趨向于抗炎微環(huán)境。

參考文獻(xiàn)：

Zhang YH, Xie R, Dai CS, et al. Thyroid hormone receptor-beta agonist HSK31679 alleviates MASLD by modulating gut microbial sphingolipids. J Hepatol.?Published online August 22, 2024. doi:10.1016/j.jhep.2024.08.008

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