1.1?植物組織：CTAB法

1. 液氮研磨樣品，分裝至離心管中
2. 向離心管中加入 CTAB，水浴
3. 離心后向上清中加入氯仿/異戊醇（24:1），離心
4. 向上清中加入異丙醇和乙酸鈉溶液，離心，棄上清
5. 加入 75％乙醇，離心，棄上清
6. 晾干，加入 TE ?溶解 DNA ，保存在-20℃冰箱

1.2?動物組織：SDS法

1. 液氮研磨組織樣，分裝至離心管中
2. 加入 SDS 溶液，水浴
3. 加入 NaCl 溶液，靜置后離心
4. 向上清中加入氯仿/異戊醇（24:1）后離心
5. 向上清中加入異丙醇后離心，棄上清
6. 加入 75％乙醇，離心，棄上清
7. 晾干，加入 TE 溶解 DNA，保存在-20℃冰箱

1.3?動物血液：Kurabo 試劑盒法

QuickGene DNA whole blood kit S (DB-S)，廠家：Kurabo，貨號：40321300101

1.4?粗體核酸純化

• 試劑盒名稱：QIAGEN Genomic-tip 20/G，廠家：QIAGEN，貨號：10223
• 試劑盒名稱：QIAGEN Genomic-tip 100/G，廠家：QIAGEN，貨號：10243

1.5?微生物樣本

使用TGuide S96磁珠法土壤/糞便基因組DNA提取試劑盒完成核酸的提取

2、檢測方法

2.1檢測方法

• 濃度檢測

Nanodrop：賽默飛 Thermo ，型號 NANODROP2000

Qubit：廠家YEASEN, 型號CAT 12642-A ，試劑1XdsDNA HS Assay kit for Qubit

• 完整性檢測（瓊脂糖凝膠電泳）

電泳儀：廠家：Monad?，型號 Universal – P

電泳槽：廠家：Tanon，型號：HE- 120

2.2?判定標準

• 總量≥6μg（單次建庫）
• 濃度≥50ng/ul
• 體積≥10(ul)
• OD260/280在7-2.2之間，OD260/230在1.8-2.5之間
• AGE：size≥23K，降解條帶>5K，點樣孔無或有輕微污染，N/Q在8-2.5之間
• 樣本狀態(tài)正常，樣本粘稠、顏色異常、有渾濁或不溶物均不合格

注：特殊物種實驗人員會根據(jù)經(jīng)驗進行判斷，具體以檢測報告中的判斷結(jié)果為準

3、建庫方法

DNA 打斷

1. 加入75-1.5 μg gDNA，補Elution Buffer 至100 μL，將gDNA樣品稀釋到終濃度為7.5 ng/μL -15 ng/μL。小心轉(zhuǎn)移到g-TUBE 管中，4600rpm離心2分鐘
2. 重復離心，直至全部gDNA樣品通過g-TUBE孔洞
3. 倒置g-TUBE管，離心2分鐘
4. 收集打斷好的gDNA樣品于新的5 mL低吸附離心管中

PB純化

1. 將gDNA樣品稀釋到100 μL，若體積超過100 μL，則不需要稀釋
2. 向樣品中中加入45*體積的AMPure PB磁珠（室溫平衡30分鐘）
3. 使用寬口槍頭輕輕吹打15次，混勻上述樣品，瞬離1秒
4. 室溫放置30分鐘，瞬離1秒
5. 轉(zhuǎn)移離心管到磁力架上，直至磁珠完全吸附，將上清液轉(zhuǎn)移到新離，備用
6. 使用5ml 新配的80%酒精洗滌磁珠，30秒后棄掉酒精，重復一次
7. 瞬離1s，將酒精棄凈
8. 向管中加入20 μL 1X Elution Buffer，使用寬口槍頭輕輕吹打15次，進行混勻
9. 10-15分鐘溶解DNA，瞬離1秒
10. 吸取20 μL上清液于新的5 mL低吸附離心管中
11. 取1 μL稀釋5倍，使用Qubit進行濃度測定

DNA修復

• 向純化產(chǎn)物中分別加入以下試劑

• 使用寬口槍頭輕輕吹打10次，混勻上述樣品，瞬離1秒
• 向每個樣品中加入14μL Reaction Mix 1
• 使用寬口槍頭輕輕吹打10次，混勻，瞬離1秒
• 孵育

接頭連接

• 向上述產(chǎn)物中分別加入以下試劑

• 使用寬口槍頭輕輕吹打10次，混勻上述樣品，瞬離1秒
• 向每個樣品中加入35μL Reaction Mix 2
• 使用寬口槍頭輕輕吹打10次，混勻，瞬離1秒
• 孵育

PB純化

• 向樣品中中加入1*體積的SMRT bell cleanup beads（室溫平衡30分鐘）
• 使用寬口槍頭輕輕吹打15次，混勻上述樣品，瞬離1秒
• 室溫放置10分鐘，瞬離1秒
• 轉(zhuǎn)移離心管到磁力架上，直至磁珠完全吸附，將上清液轉(zhuǎn)移到新離，備用
• 使用5ml新配的80%酒精洗滌磁珠，30秒后棄掉酒精，重復一次
• 瞬離1s，將酒精棄凈
• 向管中加入40μL1XElutionBuffer，使用寬口槍頭輕輕吹打15次，進行混勻
• 室溫5分鐘溶解DNA，瞬離1秒
• 吸取40μL上清液于新的5mL低吸附離心管中
• 取1μL稀釋5倍，使用Qubit進行濃度測定

酶處理

• 向上述純化產(chǎn)物中分別加入以下試劑

• 使用寬口槍頭輕輕吹打10次，混勻上述樣品，瞬離1秒
• 孵育

PB磁珠片段篩選

1. 向上述產(chǎn)物中加入1*體積的2.85*稀釋的AMPurePB磁珠（室溫平衡30分鐘）
2. 使用寬口槍頭輕輕吹打15次，混勻上述樣品，瞬離1秒
3. 室溫放置20分鐘，瞬離1秒
4. 轉(zhuǎn)移離心管到磁力架上，直至磁珠完全吸附，將上清液轉(zhuǎn)移到新離心管，備用
5. 使用5ml新配的80%酒精洗滌磁珠，30秒后棄掉酒精，重復一次
6. 瞬離1s，將酒精棄凈
7. 向管中加入1X Elution Buffer，使用寬口槍頭輕輕吹打15次，進行混勻
8. 室溫10-15分鐘溶解DNA，瞬離1秒
9. 吸取上清液于新的5mL低吸附離心管中
10. 取1μL稀釋5倍，使用Qubit進行濃度測定。純化后DNA樣品可以在4℃保存2周，可以長期保存于-20℃，但避免反復凍融

4、測序方法

• 最終文庫通過濃度（Qubit）及大?。ˋgilent 5400）的檢測，總量需要大于Smrtlink計算值。
• 使用REVIO SPRQ POLYMERASE KIT（Pacbio，USA） 對上機文庫進行上機前的結(jié)合，使文庫結(jié)合上Primer（Pacbio，USA）及Polymerase（Pacbio，USA）
• 將最終的反應產(chǎn)物進行SMRTbell cleanup beads（Pacbio，USA）純化后置于Revio（Pacbio，USA）測序儀上進行測序

5、實驗用試劑

6、實驗用設備

1、提取方法

1)植物葉片：（天根 DP441（廠家：天根，型號：DP441）

2)植物根、莖、種子：艾德萊 RN40（廠家：艾德萊，型號：RN40））試劑盒

3)動物常規(guī)組織：TRIzol

4)皮膚、毛發(fā)：凱捷 217044（廠家：凱捷。型號：217004）

5)全血PAX管送樣：PAXgene Blood miRNA Kit(50)（廠家：GENENODE。型號：2145A）試劑盒

6)EDTA抗凝血：TRIzol

2、檢測方法

2.1檢測方法

使用 Nanodrop2000 （廠家：賽默飛，型號 ：Nanodrop2000）對于提取的核酸進行濃度純度檢測，并使用 LabChip GX（廠家：鉑金埃爾默，型號：LabChip GX Touch HT）對完整性進行檢測

2.2判定標準

1)總量≥1（ug），滿足 2 次建庫

2)濃度≥20（ng/ul）

3)體積≥10(ul)

4)OD260/280 在 1.7-2.5 之間，OD260/230 在 0.5-2.5 之間，260nm 吸收峰顯示正常

5)RIN值≥8（非植物），RIN值≥7.5（植物），同時若GX檢測6.0-6.4的需結(jié)合基線判斷，28S/18S≥1 且基線無上抬或輕微上抬

6)樣本狀態(tài)正常，樣本粘稠、顏色異常、有渾濁或不溶物均不合格

3、建庫方法

3.1建庫流程

1) 全長cDNA的合成

A.取新的0.2mL PCR管，置于冰上，加入如下試劑

B.輕彈混勻，瞬時離心，置于PCR儀上

C.70℃反應 5 min ，20℃ hold（80℃熱蓋），立即進行下步反應

D.在上步反應期間，配制如下Mix

E.輕彈混勻，瞬時離心

F.取 cDNA 反應產(chǎn)物 9 μL 中加入 10 μL 上述 Mix

G.輕彈混勻，瞬時離心

H.42℃反應 45 min ，20℃ hold（52℃熱蓋），立即進行下步反應

I.向反應完的產(chǎn)物中加入 2 μL Iso-Seq template switch oligo ，總體積達到 21 μL

J.輕彈混勻，瞬時離心

K.42℃反應 15 min ，4℃ hold（52℃熱蓋）

2)磁珠純化

A.將上步反應產(chǎn)物（21μL），移入新的1.5mL低吸離心管中，加入29μLElutionBuffer

B.向1.5mL離心管中加入1.3×（65μL）體積的SMRTbellcleanupbeads磁珠（室溫平衡30min），充分輕彈混勻

C.室溫孵育10min

D.瞬時離心，將樣品置于磁力架上至上清液澄清（約2min）

E.棄上清，保持離心管于磁力架上，沿對壁加200μl的新配置的80%乙醇（注意不要吹起磁珠），靜置30s

F.棄上清，重復漂洗一次

G.瞬時離心，用10μl槍頭棄盡上清，室溫干燥1min

H.向離心管中加入21μL的ElutionBuffer，輕彈混勻，室溫孵育5min

I.置于磁力架上2min，轉(zhuǎn)移上清液至新200μL離心管

3)cDNA擴增

A.取一新的1.5mL 離心管，加入如下試劑

Reagent Volume（μL）

B.向純化產(chǎn)物中加入27μl上述mix

C.加入2μlIso-SeqprimerBarcode，總體積達到50μl

D.充分輕彈混勻，瞬時離心

E.按照下面反應程序反應

4)磁珠純化

A.將上步PCR產(chǎn)物分別導入一新的1.5mL低吸離心管中

B.向50μL體積1.5mL離心管中加入0.9X（45μL）體積的SMRTbell cleanup beads磁珠，充分混勻，瞬時離心

C.室溫孵育10min

D.瞬時離心，將樣品置于磁力架上至上清液澄清（約2min）

E.棄上清，保持離心管于磁力架上，沿對壁加入200μl新配置的80%乙醇，靜置30s

F.棄上清，重復漂洗一次

G.棄盡上清，室溫干燥1min

H.向離心管分別加入24μL的Elution Buffer，輕彈混勻，室溫孵育5min

I.置于磁力架上2min，轉(zhuǎn)移上清液至新1.5mL離心管

J.取2μL稀釋液進行Qubit定量，確定PCR產(chǎn)物總

5)混樣

A.根據(jù) Qubit 檢測結(jié)果、數(shù)據(jù)需求量進行混樣，混樣總量達到 55ng ，置于冰上

B.輕彈混勻，瞬時離心

6)kinnex PCR

A.分別加入以下試劑

B.分 22.5 μL 的 Mix 產(chǎn)物加入到 8 連排管中

C.每管中加入2.5μL Kinnex primer mix A-HQ

D.輕彈混勻，瞬時離心

E.按照下面反應程序反應

7)磁珠純化

A.將上步PCR產(chǎn)物分別導入一新的1.5mL低吸離心管中，總體積184μL

B.向1.5mL離心管中加入1.05X（193μL）體積的SMRTbell cleanup beads磁珠，充分混勻，瞬時離心

C.室溫孵育10min

D.瞬時離心，將樣品置于磁力架上至上清液澄清（約2min）

E.棄上清，保持離心管于磁力架上，沿對壁加入200μl的新配置的80%乙醇，靜置30s

F.棄上清，重復漂洗一次

G.棄盡上清，室溫干燥1min

H.向離心管分別加入24μL的Elution Buffer，輕彈混勻，室溫孵育5min

I.置于磁力架上2min，轉(zhuǎn)移上清液至新1.5mL離心管

J.取2μL稀釋液進行Qubit定量，確定PCR產(chǎn)物總量

8)串聯(lián)

A.分別加入以下試劑

B.配置以下mix

C.向41μL反應產(chǎn)物中加入17μL的mix，輕彈混勻，瞬時離心

D.45℃反應60min，4℃hold（52℃熱蓋）

E.加入2μLDNArepairmix，輕彈混勻，瞬時離心

F.45℃反應30min，4℃hold（60℃熱蓋）

9)磁珠純化

A.將上步反應產(chǎn)物移入新的1.5mL低吸離心管中，總體積60μL

B.向1.5mL離心管中加入1×（60μL）體積的SMRTbellcleanupbeads磁珠（室溫平衡30min），充分輕彈混勻

C.室溫孵育10min

D.瞬時離心，將樣品置于磁力架上至上清液澄清（約2min）

E.棄上清，保持離心管于磁力架上，沿對壁加200μl的新配置的80%乙醇（注意不要吹起磁珠），靜置30s

F.棄上清，重復漂洗一次

G.瞬時離心，用10μl槍頭棄盡上清，室溫干燥1min

H.向離心管中加入40μL的ElutionBuffer，輕彈混勻，室溫孵育5min

I.置于磁力架上2min，轉(zhuǎn)移上清液至新200μL離心管

J.使用Qubit檢測濃度

10)酶處理

A.向上述純化產(chǎn)物中分別加入以下試劑

B.使用寬口槍頭輕輕吹打10次，混勻上述樣品，瞬離1s

C.孵育

11)PB磁珠片段篩選

A.向上述產(chǎn)物中加入3.1*體積的 2.85*稀釋的AMPure PB磁珠（室溫平衡30分鐘）

B.使用寬口槍頭輕輕吹打15次，混勻上述樣品，瞬離1s

C.室溫放置20min，瞬離1s

D.轉(zhuǎn)移離心管到磁力架上，直至磁珠完全吸附，將上清液轉(zhuǎn)移到新離心管，備用

E.使用1.5ml 新配的80%酒精洗滌磁珠，30秒后棄掉酒精，重復一次

F.瞬離1s，將酒精棄凈

G.向管中加入 1X Elution Buffer，使用寬口槍頭輕輕吹打15次，進行混勻

H.室溫10-15min溶解DNA，瞬離1s

I.吸取上清液于新的1.5 mL低吸附離心管中

J.取1 μL稀釋5倍，使用Qubit進行濃度測定。純化后DNA樣品可以在4℃保存2周，可以長期保存于-20℃，但避免反復凍融

4、測序方法

1)最終文庫通過濃度（Qubit）檢測，總量需要大于Smrtlink

2)使用REVIO SPRQ POLYMERASE KIT（Pacbio，USA） 對上機文庫進行上機前的結(jié)合，使文庫結(jié)合上Primer（Pacbio，USA）及Polymerase（Pacbio，USA）

3)將最終的反應產(chǎn)物進行SMRTbell cleanup beads（Pacbio，USA）純化后置于Revio（Pacbio，USA）測序儀上進行測序

5、實驗試劑

6、實驗設備