三代微生物多樣性是基于?PacBio 測(cè)序平臺(tái)，利用單分子實(shí)時(shí)測(cè)序（SMRT Cell）的方法對(duì) marker 基因進(jìn)行測(cè)序，之后通過(guò)對(duì) CCS（Circular Consensus Sequencing）序列過(guò)濾，得到 Optimization-CCS 進(jìn)行 OTUs（Operational Taxonomic Units）聚類，并進(jìn)行物種注釋及豐度分析，可以揭示樣品的物種構(gòu)成； 進(jìn)一步進(jìn)行α多樣性分析（Alpha Diversity）、β多樣性分析（Beta Diversity）和顯著物種差異分析等等，可以挖掘?樣品之間的差異。

目前，微生物多樣性研究主要是于編碼核糖體RNA的核酸序列保守區(qū)進(jìn)行的。細(xì)菌主要是基于16S區(qū)，真菌主要基于18S區(qū)或ITS區(qū)（內(nèi)轉(zhuǎn)錄間區(qū)），16S rDNA 是編碼原核生物核糖體小亞基rRNA（16S rRNA）的DNA序列，18S rDNA是編碼真核生物核糖體小亞基rRNA（18S rRNA）的DNA序列，ITS是編碼真核生物核糖體小亞基rRNA的DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列。這些序列中既有保守區(qū)又有可變區(qū)，保守序列區(qū)域反映了生物物種間的親緣關(guān)系，而高變序列區(qū)域則能體現(xiàn)物種間的差異。由于18S rDNA在進(jìn)化速率上比較保守，在系統(tǒng)發(fā)育研究中較適用于種級(jí)以上階元的分類。常用作微生物分類研究的ITS分為ITS1和ITS2兩種。ITS1位于真核生物核糖體rDNA序列的18S和5.8S之間，ITS2位于真核生物核糖體rDNA序列5.8S和28S之間。由于ITS區(qū)在核糖體RNA加工過(guò)程中被剪切掉，不發(fā)揮功能作用，在進(jìn)化過(guò)程中選擇壓力較小，進(jìn)化速率約為18S rDNA的10倍，屬于中度保守的區(qū)域，利用它可研究種及種以下的分類階元。另外，也可通過(guò)選擇引物同時(shí)擴(kuò)增18S rDNA和ITS，通過(guò)分析18S rDNA序列，先在較高級(jí)別上確定樣品的歸屬，然后根據(jù)ITS 序列，將真菌歸類到種或亞種水平。

我們對(duì)不同類型的樣品如：土壤、糞便、腸道、水體等，隨機(jī)挑選了30個(gè)項(xiàng)目對(duì)其進(jìn)行物種注釋率進(jìn)行研發(fā)優(yōu)化，目前采用優(yōu)化數(shù)據(jù)庫(kù)及注釋方法的策略，將其種水平平均注釋率提升到60%+。二代注釋到屬和種的平均比例為78%和6%，相同樣品采用三代進(jìn)行注釋時(shí)，屬和種水平平均注釋率為95%和60%，注釋結(jié)果提升非常明顯。

測(cè)序數(shù)據(jù)量飽和度

基于PacBio SMRT單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)可以對(duì)DNA序列實(shí)現(xiàn)單分子級(jí)別的超長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序，能夠輕易實(shí)現(xiàn)對(duì)環(huán)境樣品中rDNA/ITS/功能基因進(jìn)行全長(zhǎng)測(cè)序，不受制于短序列的局限性，提供了種甚至菌株水平的物種分辨率，更全面的解釋物種的多樣性。

統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)結(jié)果顯示：?jiǎn)螛颖?000條CCS即可達(dá)到飽和。

建庫(kù)測(cè)序：

提取樣品總 DNA 后，根據(jù) 16S 全長(zhǎng)引物 27F 和 1492R（及其他全長(zhǎng)引物），合成帶有 Barcode 的特異引物，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增并對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行純化、定量和均一化形成測(cè)序文庫(kù)（SMRT Bell），建好的文庫(kù)先進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫(kù)用 PacBio Sequel 進(jìn)行測(cè)序。PacBio Sequel下機(jī)數(shù)據(jù)為 bam 格式,通過(guò) smrtlink 分析軟件導(dǎo)出 CCS 文件, 根據(jù) Barcode 序列識(shí)別不同樣品的數(shù)據(jù)并轉(zhuǎn)化為 fastq 格式數(shù)據(jù)。

生信流程：

數(shù)據(jù)預(yù)處理：將 PacBio 下機(jī)數(shù)據(jù)導(dǎo)出為 CCS 文件( CCS 序列使用 Pacbio 提供的 smrtlink 工具獲取)后，主要有如下3個(gè)步驟：

1)CCS識(shí)別：使用?lima v1.7.0軟件，通過(guò)barcode對(duì)CCS進(jìn)行識(shí)別，得到的Barcode-CCS序列數(shù)據(jù)；

2)CCS長(zhǎng)度過(guò)濾：使用百邁客公司自主研發(fā)的軟件，對(duì)Barcode-CCS進(jìn)行過(guò)濾，得到有效序列；

3)去除嵌合體：使用?UCHIME v4.2軟件，鑒定并去除嵌合體序列，得到 Optimization-CCS 序 列。

信息分析內(nèi)容：劃分OTU、多樣性及差異性分析（具體見(jiàn)分析結(jié)果）。

案例展示

案例一：

Bacterial compatibility and immobilization with biochar improved tebuconazole degradation, soil microbiome composition and functioning

發(fā)表時(shí)間：2020

合作單位：青島農(nóng)業(yè)大學(xué)

發(fā)表期刊： Journal of Hazardous Materials

研究背景：戊唑醇?xì)⒕鷦┦且环N應(yīng)用廣泛的殺菌劑，對(duì)水生生物和人類健康具有潛在威脅。微生物降解農(nóng)藥是一種高效、低成本和環(huán)境友好的方法。本研究假設(shè)生物炭可能是降解戊唑醇細(xì)菌的理想載體，而固定化生物炭比自由施用的細(xì)菌可能加速戊唑醇從土壤中的去除。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，我們以麥秸源生物炭為載體，利用戊唑醇降解菌WZ-2對(duì)污染土壤進(jìn)行生物修復(fù)。

測(cè)序策略： Pacbio SequelII 全長(zhǎng)16S測(cè)序

研究結(jié)論：菌株WZ-2和固定化生物炭的WZ-2加速了戊唑的降解，使戊唑在土壤中的半衰期分別從40.8天降低到18.7天和13.3天。雖然戊唑醇對(duì)土壤酶活性(脲酶、脫氫酶、轉(zhuǎn)化酶)和微生物群落結(jié)構(gòu)有負(fù)面影響，但固定化生物炭的WZ-2不僅加速了戊唑醇的降解，而且恢復(fù)了土壤微生物酶活性和微生物群落組成。

案例二：

Arsenic exposure induces intestinal barrier damage and consequent activation of gut-liver axis leading to inflammation and pyroptosis of liver in ducks

發(fā)表時(shí)間：2021

合作單位：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)

發(fā)表期刊： Science of the Total Environment

研究背景：砷是一種重要的有害金屬，普遍存在于受污染的土壤、河流和地下水中。然而，關(guān)于三氧化二砷(ATO，砒霜)對(duì)水禽腸-肝軸的影響及其肝毒性的研究還很少。本研究探討了腸-肝軸在三氧化二砷誘導(dǎo)的肝毒性和腸道毒性中的作用。

測(cè)序策略：Pacbio SequelII 全長(zhǎng)16S

測(cè)序 研究結(jié)論： ATO暴露可引起鴨腸道菌群α-多樣性顯著降低， 對(duì)照組中凸腹真桿菌、產(chǎn)硫球鏈菌、類腸膜魏斯氏菌和厭氧消化鏈球菌等更豐富。ATO暴露顯著降低腸道屏障相關(guān)蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致腸道通透性增加和脂多糖水平升高；上調(diào)了肝臟和空腸的焦亡相關(guān)指數(shù)，并增加了促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。進(jìn)一步的機(jī)制研究表明，ATO誘導(dǎo)的肝臟和空腸炎癥是由LPS/TLR4/NF-κB信號(hào)通路和NLRP3炎癥小體的激活引起的。這些結(jié)果表明，ATO暴露可導(dǎo)致肝臟和空腸炎癥和焦亡，而間接的腸-肝軸通路可能在ATO誘導(dǎo)肝毒性的潛在機(jī)制中發(fā)揮重要作用。

我們的優(yōu)勢(shì)

• 1.PB全長(zhǎng)多樣性測(cè)序基于HiFi模式對(duì)單一片段進(jìn)行多輪測(cè)序的方式來(lái)提升準(zhǔn)確性。由于Pacbio的原始錯(cuò)誤為隨機(jī)錯(cuò)誤，可通過(guò)獲取CCS進(jìn)行自身糾正來(lái)提升數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。同一片段測(cè)序 5 次后，單一Read的準(zhǔn)確性至少達(dá)到Q20（99%）。
• 2.全長(zhǎng)序列中攜帶的特征信息更多，可以支持“種”水平的分辨率；
• 3.群落結(jié)構(gòu)更準(zhǔn)確，避免了短讀長(zhǎng)擴(kuò)增子的PCR引物選擇會(huì)影響推斷的群落準(zhǔn)確性和某些細(xì)菌類群的敏感性；
• 4. CCS擴(kuò)增子測(cè)序模式結(jié)合DADA2軟件算法，可獲得單堿基/近零錯(cuò)誤率的全長(zhǎng)rRNA基因序列。

常見(jiàn)問(wèn)題